Leuconostoc mesenteroides 돌연변이체의 내산성 관련 유전자에 대한 특성 규명
- 주제(키워드) Lactic acid bacteria , acid tolerance
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 이평천
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000027948
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Lactic acid, including L and D forms, is an industrially important raw material and is widely used in the cosmetics, pharmaceutical and food industries. Lactic acid bacteria (LAB), including Lactobacillus, Lactococcus and Leuconostoc, are now used as lactic acid producers in the biotechnology industry. Nevertheless, in order to production lactic acid, it is necessary to overcome limitations such as inhibition of cell growth due to low pH in cells during fermentation, decrease of core enzyme activity, and membrane damage. To understand the acid-tolerance mechanism of LAB, we performed NGS analysis for acid-resistant mutant strain by applied adaptive evolution strategy, producing only pure D-lactic acid. We have verified the mutation of major genes related to acid-tolerance through full genome sequencing. Resistant strain to high lactic acid concentrations were also found to be highly tolerance to high acid conditions. We also found that the morphological differences between wild-type and mutant strains were derived from genetic mutations that occurred as adaptive evolution at high lactic acid concentrations. Based on the genetic information we have identified, we have selected a number of candidates that are closely related to the acid mechanism. In this study, we performed studies on other resistance-related genes, such as malonyl-CoA acyl transacylase (fabD), which is involved in fatty acid synthesis, and lexA repressor (lexA), which is associated with SOS response. The DNA repair protein (recA, uvrA, uvrD) genes were upregulated as the expression of the transcriptional repressor (lexA) gene of the mutant strain was down-regulated under acidic conditions. We have demonstrated increased acid resistance by heterologous overexpression of the mutant gene of malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (fabD). It is also expected that the predicted protein structure will provide useful information to understand the role of proteins in catalytic mechanisms and to find causes to improve the acid resistance of each protein. We predicted that the protein structure of the mutant gene due to the deleted amino acid corresponding to alpha helix in the substrate binding region would promote fatty acid synthesis.
more초록/요약
L형 또는 D형 형태를 가지며, 산업적으로 이용가치가 높은 젖산은 화장품, 제약 및 식품 산업에서 널리 사용되고 있다. Lactobacillus, Lactococcus 및 Leuconostoc을 포함한 젖산균(Lactic Acid Bacteria, LAB)은 생명 공학 산업에서 젖산 생산자로 널리 사용된다. 이러한 미생물을 이용한 젖산 생산은 기존 화학 석유기반의 젖산 생산보다 광학순도가 높은 젖산을 생산할 수 있다는 이점을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고, 미생물 발효를 이용한 젖산 생산은 세포 내의 낮은 pH로 인한 세포 성장의 억제, 핵심 효소 활성의 감소 및 막 손상과 같은 한계를 극복 할 필요가 있다. 이전 연구에서 우리는 LAB의 산-내성 기작을 규명하고, 젖산 과생산 균주를 개발하기 위해 순수 D형 유산만을 생산하는 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KCTC 3718에 젖산에 대한 적응진화 전략을 적용하여 돌연변이 균주를 개발하였다. 본 연구에서는 돌연변이 균주에 대한 산-내성 기작을 이해하기 위해 차세대 염기서열(Next-Generation Sequencing, NGS) 분석을 수행했다. 우리는 완전한 게놈 시퀀싱을 통해 내산성과 관련된 주요 유전자의 돌연변이를 확인하였고, 높은 젖산 농도에 저항성이 있는 돌연변이 균주는 산성 조건에 대해서 또한 내성이 강한 것으로 밝혀졌다. 돌연변이 균주의 유전적 정보를 바탕으로 우리는 산성 메커니즘과 밀접한 관련이 있을 것으로 예상되는 후보 유전자를 선정했다. 산성조건에서 돌연변이 균주의 transcriptional repressor (lexA) 유전자의 발현이 하향 조절됨에 따라 DNA repair protein (recA, uvrA, uvrD) 유전자들이 상향 조절됨을 알 수 있었고, 지방산 합성과 관련된 malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (fabD)의 돌연변이 유전자를 이종 과발현시켜 증가된 내산성을 입증하였다. 또한 예측 된 단백질 구조는 촉매 메커니즘에서 단백질의 역할을 이해하고 각 단백질의 내산성을 향상시키는 원인을 찾는 데 유용한 정보를 제공 할 것으로 기대된다. Malonyl기의 sulfuric acid 이온과 binding함으로써 malonyl기를 이동시키는 malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (fabD)의 substrate binding region 중 알파 헬릭스 구조에 해당되는 제거된 아미노산으로 인해 변형된 단백질 구조가 지방산 합성을 촉진 할 것으로 예상할 수 있다.
more목차
1. Introduction 1
2. Materials and Methods 6
2.1 Bacterial strains.. 6
2.2 Production of D-lactic acid. 6
2.3 Analytical methods 6
2.4 RNA extraction and RT-PCR.. 7
2.5 Detection of cell viability.... 7
2.6 Computational three-dimensional protein structures 8
2.7 Genome sequencing and comparison 8
2.8 Plasmid construction and expression 8
3. Results and Discussion.. 13
3.1 Resequencing of Leuconostoc mesenteroides KCTC 3718. 13
3.2 Identification of putative D-lactic acid dehydrogenase genes related to D-lactic acid synthesis 16
3.3 Effects of glucose consumption on D-lactic acid production 20
3.4 Complete genome sequencing of L.mesenteroides mutant strain LM100A 22
3.5 Cell viability of L.mesenteroides wild-type and mutant strains by plate assay. 25
3.6 Transcriptional analysis of expected acid tolerance related genes under acidic condition and normal condition.. 27
3.7 Effects of malonyl-CoA acyl carrier protein transacylase (fabD) on acid tolerance by heterologous expression in Escherichia coli... 29
3.8 Computational 3D structures of malonyl-CoA acyl carrier protein transacylase (FabD) 31
3.9 Morphology of L.mesenteroides wild-type and mutant strains 33
4. Conclusion. 35
5. References. 36
6. Abstract in Korean. 38
7. Appendix. 40
