미토콘드리아 내 다황화수소 검출을 위한 이광자 가변색 표지자의 개발
Two-photon Ratiometric Fluorescent Probe for Detection of Mitochondrial Hydrogen Polysulfides
- 주제(키워드) Hydrogen polysulfide; fluorescent probe; mitochondria; Parkinson’s disease; two-photon microscopy
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김환명
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 에너지시스템학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000027899
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
다 황화수소; Hydrogen polysulfides (H2Sn, 1<n<8)는 가스 신호전달물질인 H2S와 reactive species (ROS, RNS)의 상호반응에 생성되는 RSS(reactive sulfur species) 일종이다. 우리 연구실에서는 앞서 파킨슨병 (Parkinson’s Disease) 뇌에서 미토콘드리아에 존재하는 Hydrogen monosulfide (H2S)과 파킨슨병의 관계를 조사하였다. H2S와 H2Sn이 산화 환원 파트너이며 많은 생물학적 메커니즘에서 비교가 되고 있는 바, 본 연구에서는 이를 이어 생체 내 H2Sn를 장시간 관찰 할 수 있는 이광자 가변색 형광 표지자 H2Sn-mito를 합성하였다. H2Sn-mito는 생체 외뿐 만 아니라 생체 내에서도 매우 탁월한 형광효율, 다 황화수소와의 선택성, 반응성, 이광자 여기 형광 그리고 파랑에서 초록으로 가변하는 형광을 보였다. 이렇게 가변하는 이광자 형광의 비를 통하여 파킨슨병 뉴런에서 H2S가 감소하고 H2Sn이 증가 된 반대의 양상을 확인하여 산화 환원 신호를 관찰 할 수 있었다. 이어서 파킨슨병 뇌조직에서도 여러 부위에서 H2Sn의 생성이 크다는 것을 확인하였다. 이러한 발견은 파킨슨병의 뇌에서 미토콘드리아의 산화스트레스로 인한 H2Sn 생성을 증명한 것과 동시에 산화 환원 메커니즘과 같은 생명 현상 연구에도 기여를 할 것이라 기대한다.
more목차
차 례
논문요약 ⅰ
본문차례 ii
그림차례 iv
Ⅰ. 서론 1
1. 이광자 형광 1
2. 생체 내 다 황화수소 (H2Sn, n>1) 2
(1) 다 황화수소의 생성과 분포 2
(2) 다 황화수소의 역할 4
(3) 미토콘드리아 내 황화수소 검출 표지자의 필요성 4
3. 표지자의 고안과 감응 메커니즘 6
Ⅱ. 본론 8
1. H2Sn-mito의 합성 8
(1) 형광체 합성 (Mito-dye) 9
(2) Receptor 합성 10
(3) H2Sn-mito 합성 12
2. H2Sn-mito의 광물리적 성질 13
(1) 물에 대한 용해도(Water solubility) 측정 13
(2) 물에서의 형광효율(Quantum Yield) 측정 15
(3) 몰 흡광계수 측정 (Molar extinction coefficient) 17
(4) 이광자 형광효율 (δΦ/GM) 측정 17
(5) 일정 농도의 다 황화수소에서 시간의 변화에 따른 형광변화 측정 및
비교 (Time dependency) 18
(6) 다 황화수소의 농도에 따른 표지자의 감응도 (Detection limit) 20
(7) 속도상수 (Kobs)와 반응차수 (K2)의 측정 21
(8) 감응 선택성 실험 (Selectivity) 22
(9) 수소이온 농도 의존성 실험 (pH dependency) 25
3. H2Sn-mito를 이용한 이광자 생체영상 26
(1) 세포 내 독성도 실험 (viability test) 26
(2) 세포 내 광 안정성 실험 (Cell photo stability test) 27
(3) 세포 내 미토콘드리아 겹침 정도 실험 (co-localization test) 28
(4) 외부주입의 다 황화수소 세포영상 (exogenous H2Sn source cell-
imaging) 29
(5) 내부생성의 다 황화수소 세포 영상 (endogenous H2Sn source cell-
imaging) 31
(6) 파킨슨병 뉴런세포 영상 (Parkinson’s disease neuronal cell-imaging) 33
(7) 파킨슨병 뇌조직 영상 (Parkinson’s disease brain tissue-imaging) 36
Ⅲ. 결론 38
Ⅳ. 참고문헌 39
그림 차례
Figure 1. (a) Mechanism of one-photon and two-photon excited fluorescence (b) Localization of one-photon and two-photon excited fluorescence. 2
Figure 2. (a) Hydrogen Sulfide oxidation pathways in Mitochondria (b) Structures of some biologically relevant RSS chemotypes and oxidation number. 3
Scheme 1. The structure and moieties of H2Sn-mito 6
Scheme 2. Possible Internal Charge transfer of H2Sn-mito with H2Sn 7
Figure 3. Reaction mechanism of H2Sn-mito 8
Figure 4. (a) One-photon fluorescence spectra and (b) plot of fluorescence intensity against the Concentration of H2Sn-mito in PBS buffer 14
Figure 5. Normalized absorption emission spectra of (a) H2Sn-mito and (b) Mito-dye in PBS buffer and relatively nonpolar PBS buffer 16
Table 1. Photophysical Data for H2Sn-mito and Mito-dye. in (a) PBS buffer (b) relatively nonpolar PBS buffer 16
Figure 6. (a) One-photon absorbance spectra (b) plot of upsilon intensity against the Concentration of H2Sn-mito in PBS buffer 17
Figure 7. Two-photon action spectra of (a) H2Sn-mito and Mito-dye (b) H2Sn-mito and Mito-dye in PBS buffer and relatively nonpolar PBS buffer 18
Figure 8. Fluorescence response with time for the reactions of H2Sn-mito with Na2Sn 19
Figure 9. (a) Real-time records for fluorescence ratio changes of H2Sn-mito in the presence of Na2S2 and (b) The kobs calculated from the slope of the plot of ln [(Fmax–Ft)/Fmax] vs time 20
Figure 10. (a) Fluorescence response of H2Sn-mito to Na2S2 at varied concentrations (b) and the corresponding linear relationship between the fluorescent Ratio intensities and Na2S2 concentrations 21
Figure 11. (a) Real-time records for fluorescence ratio changes of H2Sn-mito in the presence of different concentrations of Na2S2 (b) the plot of ln [(Fmax–Ft)/Fmax] vs time and the slope means kobs, respectively (c) Plots of kobs vs Na2S2 concentration 22
Figure 12. (a) Fluorescence response of H2Sn-mito toward Na2Sn and other reactive sulfur species (b) Fluorescence response of H2Sn-mito to various reactive oxygen, nitrogen species and esterases 23
Figure 13. Fluorescence response of H2Sn-mito to various ROS and RNS in the presence of H2S 24
Figure 14. (a) Effect of pH on the fluorescence intensity ratios for H2Sn-mito and Mito-dye (b) Nomalized Fluorescence spectrum for H2Sn-mito and Mito-dye 26
Figure 15. Viability of HeLa cells in the presence of H2Sn-mito as measured by using CCK-8 kit 26
Figure 16. (a) TPM images of 2 μM H2Sn-mito-labeled HeLa cells (b) The relative TPEF ratio intensity from the A-C in Figure (a) as a function of time 28
Figure 17. TPM images of Hela cells colabeled with (a) H2Sn-mito and (b) Mitotracker Red FM (c) Merged image 29
Figure 18. (a) Pseudocolored ratiometric TPM images of Hela cells incubated with H2Sn-mito and exogenous Na2S2 of varied concentrations (b) Average intensity ratios in (a) 30
Figure 19. Pseudocolored ratiometric TPM images of Hela cells incubated with (a) Lipopolysacaride and inhibitor NEM and then labeling with H2Sn-mito and (b) H2Sn-mito (c) Lipopolysaccaride before labeling with H2Sn-mito (d) Mito-dye 32
Figure 20. Accumulated H2Sn production in alpha-synuclein overexpressing brain neuron. (a) Ratiometric TPM images of α-syn overexpressing neuron and WT cells (b) Average values of Fgreen/Fblue in TPM images calculated as described above. 34
Figure 21. Accumulated H2Sn production in alpha-synuclein overexpressing brain. (a) Cortex, Hippocampus and Substantia Nigra tissues were prepared from 1 and 2 slice, respectively. (b) Ratiometric TPM images of α-syn overexpressing brain and WT brain tissues (c) Average values of Fgreen/Fblue in TPM images calculated as described above 36
Figure 22. 1H-NMR spectrum (400 MHz) of H2Sn-mito in DMSO 40
Figure 23. 13C-NMR spectrum (400 MHz) of H2Sn-mito in DMSO 40
Figure 24. HRMS spectrum of H2Sn-mito 41
