관절염 치료를 위한 AIMP1 표적 치료용 항체 개발
Development of a Therapeutic Antibody Targeting AIMP1 for Arthritis Treatment
- 주제(키워드) Aminoacyl tRNA Synthetase Complex – interacting Multifunctional Protein 1 (AIMP1) , Rheumatoid Arthritis (RA) , Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (RANKL) , Micro-computed Tomography (μCT) , Atliximab (AIMP1 targeting , -li , -xi , mab)
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 박상규
- 발행년도 2017
- 학위수여년월 2017. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 약학
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000025487
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 1 (AIMP1) promotes the production of inflammatory cytokines from immune cells, and rheumatoid arthritis (RA) is driven by the overproduction of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), and IL-6. I measured levels of AIMP1 and inflammatory cytokines in peripheral blood (PB) and synovial fluid (SF) from patients with RA and healthy volunteers by using an enzyme-linked immunosorbent assay. Levels of TNF-α, IL-6, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), and AIMP1 were significantly higher in PB and SF from patients with RA than in PB from healthy individuals. TNF-α, IL-6, and MCP-1 play roles in osteoclastogenesis, and the levels of these inflammatory cytokines were found to directly correlate with AIMP1 levels. These results suggested that AIMP1 functions as an inflammatory cytokine in RA. To test this hypothesis, in vitro assays were performed to determine whether AIMP1 functions as a cytokine in osteoclastogenesis, a key event underlying the development of RA. AIMP1 induced osteoclastogenesis in macrophages, but not to the same extent as receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL). However, AIMP1 acted synergistically with RANKL to induce osteoclastogenesis in vitro. These findings indicated that AIMP1 mediates the production of inflammatory cytokines via a positive feedback mechanism, and that AIMP1 is an important cytokine in osteoclastogenesis. To assess the therapeutic significance of these findings, an antibody against AIMP1 was generated to neutralize the cytokine function of AIMP1. The AIMP1 antibodies were composed of IgG1/κ chains, and they specifically recognized both human and mouse AIMP1. Among the monoclonal antibodies evaluated, anti-AIMP1 15B3AF inhibited AIMP1-mediated TNF-α secretion in human monocyte cells. Anti-AIMP1 15B3AF inhibited RANKL-induced and AIMP1-induced differentiation of macrophages. Using a protein array, I determined that anti-AIMP1 15B3AF specifically bound to AIMP1. Anti-AIMP1 15B3AF interacted with the N-terminus of AIMP1, with a binding affinity of 1.137 ± 0.02 × 10−10 M. To determine if antibody-mediated neutralization of AIMP1 function attenuated RA symptoms, I generated a chimeric antibody, Atliximab (AIMP1 targeting, -li, -xi, mab), from the complementarity-determining regions of anti-AIMP1 15B3AF. In a collagen-induced arthritis (CIA) mouse model of RA, Atliximab significantly attenuated disease severity based on various histopathological parameters. Three-dimensional micro-computed tomography scanning demonstrated that Atliximab preserved joint structures in CIA mice. Furthermore, Atliximab suppressed the expression of inflammatory cytokines in the serum and inflamed joints of CIA mice. Together, these results suggest that AIMP1 exacerbates RA pathogenesis by inducing inflammation and osteoclastogenesis, and that a neutralizing antibody against AIMP1 may have therapeutic value in treating inflammatory diseases such as RA.
more초록/요약
Aminoacyl tRNA synthetase (ARS) complex-interacting multifunctional protein 1 (AIMP1)는 면역 세포의 염증성 사이토카인 생산을 증진시킨다고 알려져 있으나, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질병에서 AIMP1의 기능에 대해 알려지지 않았다. 류마티스 관절염은 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 과잉생산에 의해 야기된다. ELISA 기법을 이용하여, 관절염 환자의 말초 혈액과 관절 낭액 내 존재하는 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, sIL-6R, MCP-1)과 AIMP1를 측정하였다. 정상인의 말초 혈액과 관절염 환자의 말초 혈액의 염증성 사이토카인 양을 비교하였을 때, 관절염 환자의 말초 혈액에서 높은 수치의 염증성 사이토카인이 확인되었으며, 관절염 환자의 말초 혈액과 관절 낭액의 염증성 사이토카인 양을 비교하였을 때, 관절 낭액에서 더 높은 수치의 염증성 사이토카인이 확인되었다. 염증성 사이토카인이 증가할수록 AIMP1도 함께 증가하는 양상 또한 확인되었다. 이 결과를 통해, 염증성 사이토카인과 AIMP1과의 증가에 상호 연관성이 있음을 확인하였다. 위 결과로 염증성 사이토카인은 파골 세포 생성 과정에서 중요한 역할을 수행하고 있으므로, AIMP1 역시 파골 세포 생성 과정에서 염증성 사이토카인과 같은 역할을 할 것이라는 가설을 세웠다. 가설을 확인하기 위해, in vitro에서, AIMP1이 파골 세포 생성 과정에 관여하는지 확인하였다. AIMP1은 대식 세포의 파골 세포화를 유도하지만, RANKL만큼의 수준은 아닌 것으로 판명 되었다. 또한, AIMP1과 RANKL을 동시 처리에 의해 상호 상승 작용이 유발 되는지를 확인한 결과, 상호 상승 효과가 있는 것으로 확인되었다. AIMP1이 RANKL과의 상호 상승 작용을 통해 파골 세포 생성을 유도하므로, AIMP1에 대한 항체를 개발하여 AIMP1의 사이토카인 기능을 저해하는 관절염 치료제로 적용하고자 하였다. 정제된 AIMP1 단백질을 이용하여, 항-AIMP1단클론 항체를 제작하였다. 제작한 단클론 항체는 IgG1/κ 사슬로 구성되어 있고, 사람 AIMP1과 마우스 AIMP1을 모두 인식할 수 있는 것으로 판명되었다. 그 중 항-AIMP1 15B3AF는 사람 단핵 백혈구에서 AIMP1에 의해 유도되는 TNF-α 분비를 효과적으로 저해하였고, IL-8, MCP-1, IL-1β의 분비를 저해하였다. 마우스 수지상세포에서도 역시 AIMP1에 의해 유도되는 TNF-α, IL-8, MCP-1, IL-1β의 분비를 저해하였다. 또한, RANKL과 AIMP1에 의해 동시에 유도되는 파골 세포 생성도 저해하는 것으로 판명되었다. 염증성 사이토카인 분비 저해 효과를 나타내는 항-AIMP1 15B3AF를 이용해 키메라 항체를 제작하기 위하여, 항-AIMP1 15B3AF의 특성을 분석하였다. 먼저, protoarray chip을 이용한 분석을 통해 항-AIMP1 15B3AF는 AIMP1과 특이적으로 결합하였고, epitope mapping 을 통해 AIMP1의 N-말단 부위에 있는 epitope을 또한 확인하였다(1.137 ± 0.02 × 10−10 M). 항-AIMP1 15B3AF의 상호보완지점 (complementary determining regions)을 기반으로 하여, 키메라 항체인 Atliximab (AIMP1 targeting, -li, -xi, mab)을 디자인한 후, Atliximab을 생산하였다. Atliximab은 류마티스 관절염 동물 모델의 관절염을 완화시켰고, 다양한 병리학적 매개 변수를 향상시키는 것으로 판명 되었다. 삼차원 미세전산화 토모그래피를 통해 관절염 실험 동물의 관절 구조를 확인한 결과, Atliximab를 투여한 관절염 마우스의 관절은 정상 마우스와 비등한 형태를 유지시키고 있었으며, Atliximab은 혈청과 감염된 관절에서 염증성 사이토카인의 발현을 저해하고 있었다. 이 결과들을 토대로, AIMP1은 염증과 파골 세포 형성 과정을 유도하여 관절염을 유발시키므로, AIMP1의 염증성 사이토카인 활성을 억제하는 항체는 관절염과 같은 염증성 질병에 치료제로 적용될 수 있다.
more목차
I. INTRODUCTION - 1
1. Current of Rheumatoid Arthritis Treatment - 1
2. Osteoclastogenesis - 2
3. AIMP1 as an Inflammatory Cytokine - 5
4. Aim and Scope of This Study - 7
II. MATERIALS AND METHODS - 10
1. Preparation of Peripheral Blood and Synovial Fluid of Rheumatoid Arthritis Patients - 10
2. Enzyme-linked Immunosorbent Assay - 12
3. Development of AIMP1 Monoclonal Antibody - 13
4. Induction of Osteoclastogenesis - 17
5. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction - 18
6. Determination of Immunoglobulin Isotype - 18
7. Generation of Atliximab - 18
8. Interaction Array - 20
9. Competitive Surface Plasmon Resonance - 21
10. Collagen-induced Arthritis Mouse Model - 22
11. Assessment of Arthritic Severity - 23
12. Histopathological and Immunohistochemical Analysis - 23
13. Three-dimensional Micro-computed Tomography - 25
14. Pharmacokinetics of Atliximab - 26
15. The Analysis of Secreted TNF-α - 27
16. Toxicity Test of Atliximab - 27
17. Statistical Analysis - 28
III. RESULTS - 29
1. Inflammatory Cytokine and AIMP1 in RA Patients - 29
2. Synergic Effect of AIMP1 and RANKL on Osteoclastogenesis - 29
3. Development of AIMP1 Monoclonal Antibody - 37
4. Screening of AIMP1 Neutralizing Antibody - 59
5. Epitope Mapping of Anti-AIMP1 15B3AF Antibody - 62
6. Design of Atliximab - 72
7. The Efficacy of Atliximab on CIA Mouse Model - 77
8. Toxicity of Atliximab - 89
9. Pharmacokinetics of Atliximab - 92
IV. DISCUSSION - 94
V. CONCLUSION - 99
VI. REFERENCES - 100
VII. ABSTRACT IN KOREAN - 115
