케스페이즈 의존성 세포사멸에서 분비되는 엑소좀의 특성 규명
- 주제(키워드) 세포사멸 , 엑소좀 , 염증 , 대식세포 , Sphingosine-1-phosphate
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 최용준
- 발행년도 2017
- 학위수여년월 2017. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000024870
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
- 국문요약 - 케스페이즈 의존성 세포사멸에서 분비되는 엑소좀의 특성 규명 세포고사는 케스페이즈(caspase)라는 단백질 분해효소에 의해 일어나는 일련의 계획적인 자살과정으로 DAMP (Damage-associated molecular pattern)를 분비하지 않고 잔재들은 대식세포 등의 면역세포에 의해 제거가 되기 때문에 염증을 유발하지 않는다고 알려져 왔으나 최근의 연구에서 케스페이즈의 활성과 또 다른 시스테인계열의 단백질 분해효소인 칼파인(calpain)에 의한 DAMP와 뉴클레오좀의 분비를 주요 소견으로 하는 세포사멸기전이 존재함을 규명되었다. 세포 안에서 형성된 endosome이 Intra-luminal vesicle (ILV)를 포함하는 Multi-vesicular body (MVB)로 성숙한 뒤 세포막과 융합하여 밖으로 분비되는 엑소좀은 지질, 단백질, 핵산 등을 포함하고 있어 최근에 세포 간 신호전달물질로 각광받고 있다. 본 연구는 케스페이즈 의존성 세포사멸에서 분비되는 엑소좀의 특징과 엑소좀에 의한 골수 유래 대식세포의 분화를 알아보았다. 먼저 초고속 원심분리 법으로 분리한 vesicle의 크기는 129.6 +/- 52.2 nm로 이전에 보고된 엑소좀의 크기와 일치했고 엑소좀의 marker인 CD63, CD9, LAMP-1를 발현하고 있었다. 따라서 분리한 vesicle은 엑소좀과 유사하였으며, 본 연구자가 분리한 엑소좀은 Alix를 발현하지 않으므로 Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) complex를 이용해 합성되는 엑소좀과는 다른 합성 경로로 합성됨을 확인하였다. 분리한 엑소좀을 골수 유래 대식세포에 처리 시 IL1b의 전사와 분비를 촉진시키는데 Caspase 3, 7, 9를 knock-down시킨 세포에서 엑소좀의 분비는 줄었고 대식세포에서 IL1b의 분비도 줄었다. 엑소좀내 지질이 IL1b의 유도에 관여함을 확인하였는데 특히 생물학적 활성 대사체인 sphingosine-1-phosphate (S1P)에 의해 IL1b가 유도되었을 가능성을 확인하였고 S1P-S1P receptor signaling axis가 케스페이즈 의존성 관련 엑소좀의 분비에 관여함을 증명하였다. 핵심어 : 세포사멸, 엑소좀, 염증, 대식세포, Sphingosine-1-phosphate
more목차
I.서론 1
A.세포사멸 (Cell death) 1
B.세포외 소포 (Extracellular vesicle, EV) 3
C.엑소좀의 형성 5
D.엑소좀의 분비 8
E.엑소좀의 분리방법 9
F.엑소좀의 생물학적 역할9
G.생활성 지질 (Bioactive lipid) 10
H.연구목적 11
II.재료 및 방법 13
A.세포의 배양 및 전체 추출물 분리 13
B.세포 사멸중인 세포의 단백질 농축 13
C.Extracellular vesicle 분리 14
D.Lentivirus system을 이용한 stable 세포 구축 14
E.분리된 vesicle의 특징 규명 14
1.Western blotting 14
2.투과전자현미경(Transmission electron microscope, TEM) 15
3.Nanoparticle tracking analysis (NTA) 16
4.OPTIPREP density gradient centrifugation 16
F.골수 유래 대식세포에서 분리한 vesicle의 역할 확인 16
1.마우스 골수유래 대식세포 분리 16
2.공촛점 현미경(Confocal microscopy)을 이용한 vesicle uptake의 확인 17
3.Real-time Polymerase chain reaction (PCR) 17
III.결과 19
A.케스페이즈 의존성 세포사멸에서 분비되는 DAMP의 염증반응 유도 19
B.케스페이즈 의존성 세포사멸과 necrosis의 비교 21
C.케스페이즈 의존성 세포괴사 중인 세포에서 분리한 vesicle의 규명(Ⅰ) 23
D.케스페이즈 의존성 세포괴사 중인 세포에서 분리한 vesicle의 규명(Ⅱ) 27
E.케스페이즈 의존성 세포괴사 중인 세포에서 분리한 vesicle의 규명(Ⅲ) 29
F.케스페이즈에 의해 조절되는 엑소좀 분비 31
G.Bioacive lipid와 엑소좀의 관계 규명(Ⅰ) 33
H.Bioacive lipid와 엑소좀의 관계 규명(Ⅱ) 37
IV.고찰 39
V.결론 42
참고문헌 43
ABSTRACT 48
