D-lactate dehydrogenase 유전자를 주입한 재조합 자이모모나스 모빌리스에 의한 D형 젖산 생산
- 주제(키워드) 젖산 , D-lactate dehydrogenase , 자이모모나스
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 유연우
- 발행년도 2017
- 학위수여년월 2017. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000024339
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
최근 전세계적으로 많은 기업과 연구기관에서 고부가가치의 친환경 바이오매스 기반의 고분자화학소재를 개발하는 연구를 진행하고 있는 가운데 대표적인 바이오플라스틱 소재로 PLA(ploy lactic acid)가 각광받고 있다. PLA는 친환경 생분해성 소재로 L형과 D형으로 구분할 수 있는 젖산 (lactic acid)의 중합체이며, 중합 시 L형과 D형의 비율에 따라 강도 및 내열성이 달라진다. 하지만 젖산 생산의 국내 연구가 미흡하며, kg당 1$에 해당하는 생산단가를 맞추기 어려워 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다. 본 연구에서는 선행연구로 진행되어 전장유전체 해독이 완료된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides KFRI-MG)로부터 d-lactate dehydrogenase 유전자를 자이모모나스에 도입함으로써 최초로 D형 젖산 생산 자이모모나스를 제작하였다. 자이모모나스는 대표적인 에탄올 생산 미생물로 알려져 있으며, glucose 대사속도 및 에탄올 생산속도가 어느 미생물보다 빠르며, 내산성을 가지고 있기에 젖산 생산 미생물로 적합하다고 판단하였다. 이러한 장점을 살려 에탄올 생산 유전자인 alcohol dehydrogenase II 유전자를 결여시킨 D형 젖산 생산 자이모모나스인 MG6105를 선별하였다. MG6105는 100 g/L 포도당으로부터 45.625 g/L의 젖산을 생산하며, 생산속도 1.87 g/L/h를 확인하였다. 생산단가를 절감하기 위해 젖산 생산시 사용한 고가의 질소원(yeast extract)과 정제된 포도당(glucose)을 biomass 유래의 질소원과 탄소원으로의 전환이 요구되었다. 질소원 대체 물질로 미강과 옥수수침지액이 가능해 보였으며, 성분분석을 통해 비타민 C와 B 그리고 arginine, leucine, phenylalanine 그리고 valine 등이 젖산 생산에 영향을 주는 것으로 예측할 수 있었다. 미강과 옥수수침지액은 톤당 가격이 $120 과 $300으로 조사되었으며, 톤당 $1,900인 yeast extract에 비해 7 ~ 16배의 비용 절감을 가져올 수 있을 것으로 예측되었다. 질소원으로 미강 1% 사용 시 24시간동안 100 g/L glucose로부터 35.47 g/L의 젖산을 얻을 수 가 있었다. 탄소원인 glucose를 대체할 물질로 현미를 택하였으며, 도정이 많이 될수록 당소모 속도가 낮아지며, 9분도(백미)에 1.0% 미강을 넣어준 경우에는 현미만을 이용한 발효 결과와 같은 소모속도를 나타내어 미강에는 에너지 대사과정에 영향을 주는 중요한 물질이 있음을 확인하였다. Seed transfer culture방식을 이용해 100 g/L glucose 현미와 1.0% 미강을 이용한 배지에서, 당소모 속도 및 젖산 생산속도가 10% RM을 이용한 결과와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과를 토대로 안정적인 젖산 생산 및 에탄올의 생산을 확인할 수 있었다. 최근 각광받고 있는 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing : NGS)을 이용한 전사체 분석을 통해 야생형 ZM4 대비 MG6105의 젖산생산에 있어 up-, down-regulated 유전자를 확인한 결과, p<0.05에 해당하는 유전자는 76개로, 증가된 발현값을 가지는 유전자 25개와 감소된 발현값을 가지는 유전자 51개를 확인하였다. 여기에 hypothetical protein을 제외한 45개의 유전자는 p-value>0.05 이상인 유전자 30개와 p-value<0.05 이하인 유전자 15개로 분류할 수 있었으며, 15개 유전자는 metabolic pathway와 관련된 10개의 유전자와 flagellar assembly에 관련된 5개 유전자로 이루어져 있음을 확인하였다. Flagellar assembly 관련 유전자 5개는 p-value<0.001 이하의 값을 가지는 것으로 flagellar basal body rod protein flgC와 flgB, flagellar hook-basal body complex subunit fliE, flagellar L-ring protein과 flagellar motor switch protein fliG들이 모두 ZM4에 비해 발현값이 감소된 것으로 확인되었다. 이는 젖산이 생산됨에 따라 flagella assembly에 관련된 유전자에 영향을 주어 운동성이 떨어질 수 있을 것이라 예측할 수 있었으며, 이런 운동성 감소는 glucose uptake rate 감소와 대사활동 저하로 이어질 수 있을 것이라 추정하였다. 추가적으로 현미경을 통한 관찰에서 flagellar 가 줄어들었으며, 세포의 크기 및 운동성이 줄어든 것을 확인하였다.
more목차
I. 서 론 1
1. 배 경 1
2. PLA (Poly lactic acid) 1
3. 젖산 (Lactic acid) 6
3.1. 젖산 동향 8
3.2. 국내외 기술 동향 12
3.3. D-lactic acid 의 중요성 17
4. 자이모모나스 ZM4 ATCC 31821 18
5. 연구목적 23
II. 재료 및 방법 24
1. 실험재료 및 조성 24
1.1. 균주 및 Plasmid 24
1.2. 배지 및 배양조건 26
2. 실험방법 28
2.1. Chromosomal 및 Plasmid DNA 의 분리 28
2.2. D-lactic acid 생산을 위한 유전자 cloning 28
2.3. 형질전환(transformation by electroporation) 및 확인 방법 30
2.4. D-lactic acid 생산 능력 평가 31
2.5. 바이오매스(biomass) 전처리 31
2.6. 현미 및 미강을 이용한 생산 능력 평가 32
2.7. RNA 추출 32
3. 분석방법 34
3.1. DNA 와 RNA 정성 및 정량 34
3.2. Cell 농도 측정 34
3.3. 당 정량 및 유기산 정량 34
3.4. D-lactic acid 의 광학순도 (optical purity) 35
3.5. NAD/NADH assay 측정 35
3.6. D-ldh 의 효소활성 측정 35
3.7. Genomic DNA 를 이용한 전장 유전체분석 36
3.8. mRNA 를 이용한 전사체분석 37
III. 결과 및 고찰 38
1. D-Lactic acid 생산하는 Z. mobilis 선별 및 발효평가 38
1.1. 김치 유산균의 전장 유전체분석 38
1.2. D-lactate dehydorgenae 유전자 확보 및 형질전환을 위한 plasmid construction 41
1.3. RM 배지에서의 Mutants 발효 평가 48
1.4. NAD/NADH assay 측정 및 효소활성 측정 57
1.5. 결론 61
2. Biomass 를 이용한 발효 평가 및 미생물 안정성 평가 63
2.1. Yeast extract 대체를 위한 N-sources 평가 63
2.2. 질소원으로 미강과 옥수수침지액(CSL) 발효 평가 66
2.3. 현미를 이용한 발효평가 72
2.4. 균주 안정성 발효평가 84
2.5. 결론 90
3. NGS 기법을 활용한 전사체 분석 92
3.1. Total RNA 및 Sequencing data processing 92
3.2. DEG (Differentially Expressed genes) 분석 95
3.3. 결론 107
IV. 종합결론 109
V. 참고문헌 112
Abstract 123
