동물 세포의 세포질에서 발현된 IgG 의 중쇄와 경쇄간의 조합 여부 및 항원결합 활성 분석
초록/요약
세포질에서 발현되는 재조합 항체 (intrabody)는 세포 내의 항원을 저해하기 위한 목적으로 생명과학 분야에 사용되고 있다. 그러나 세포질은 항체 내의 시스테인 (cysteine, cys) 잔기 사이에 이황화 결합이 형성되기 어려운 환경이므로 항원 결합능력이 상실된다는 문제가 제기된다. 현재까지 세포질에 면역글로불린 G (immunoglobulin G, IgG) 항체가 발현되었을 때, 항체의 구조 및 항원 결합능력 유지 여부가 자세하게 연구된 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 키메릭 3D8 IgG1 (chimeric 3D8 IgG1, ch 3D8 IgG1) 발현벡터를 세포질에 발현시켜 중쇄와 경쇄간의 결합 및 항원 결합능력을 조사하였다. 세포질에서 발현되도록 선도 서열 (leader sequence)을 제거하여 중쇄와 경쇄를 동시에 발현하는 벡터를 제조하였다. ch 3D8 IgG1의 기본구조 외에도 중쇄의 경첩 부위 (hinge region) 및 중쇄-경쇄 사이의 cys 잔기를 세린 (Serine, Ser) 잔기로 치환한 3D8 IgG1 변이체들을 HEK293 세포질에 발현시켰다. ch 3D8 IgG1 항체를 발현시켜 얻은 세포 파쇄액을 이용하여 면역효능흡착법 (ELISA)과 면역침강법 (immunoprecipitation)으로 분자간 이황화 결합 없이도 항체의 중쇄와 경쇄간에 조합되는 것을 확인하였다. 또한 항원 결합부위 (antigen-binding site)를 특이적으로 인식하는 3D8 항-유전자형 항체 (O2F3)를 이용하여 세포질에 발현된 ch 3D8 IgG1 및 변이체들의 항원 결합능력이 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 연구는 세포질에서 발현되는 IgG 형태의 항체가 세포 내의 항원 기능 저해에 사용될 수 있는 가능성을 제시한다.
more목차
I. 서론 1
II. 재료 및 방법 7
A. 세포질 발현을 위한 키메릭 3D8 IgG1 및 그 변이체들 벡터 제작 7
B. 세포 파쇄액 추출 10
C. 면역효능흡착법 (ELISA) 10
1. 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 중쇄-경쇄간 조합 확인 10
2. DTT 첨가에 의한 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 중쇄-경쇄간 조합의 영향 분석 11
3. 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 DNA 결합 여부 확인 12
4. 3D8의 이디오톱 (idiotope)에 특이적인 O2F3항체를 통한 항원결합부위 형성 확인 12
D. 3D8의 이디오톱 (idiotope)에 특이적인 항-이디오타입 항체 O2F3 IgM 정제 13
E. 3D8 chIgG1 항체 단백질 정제 14
F. 면역침강 및 웨스턴 블롯 (Immunoprecipitation and Western blot) 14
G. 프로테아좀 저해제 처리 후 3D8 chIgG1 변이체들의 단백질 발현 수준 변화 확인 15
H. 공촛점 현미경 (Confocal microscopy) 16
1. 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 중쇄-경쇄간 조합 확인 16
2. 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 발현 위치 확인 17
III. 결과 18
A. 3D8 chIgG1 및 그 변이체들 벡터 18
B. 세포질에 발현된 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 중쇄- 경쇄간 조합 확인 20
C. DTT 첨가에 의한 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 중쇄- 경쇄간 조합의 영향 확인 27
D. 세포질에서 발현된 3D8 chIgG1 및 그 변이체들의 DNA결합 여부 확인 29
E. 3D8의 이디오톱 (idiotope)에 특이적인 O2F3항체를 통해 세포질에서 발현된 3D8 chIgG1의 항원결합부위 형성 확인 31
IV. 고찰 34
V. 결론 37
참고문헌 38
ABSTRACT 43
