EGFR-매개 Ras 신호전달에 관여하는 Bcl-xL의 새로운 역할 규명
Novel Molecular Mechanism of Bcl-xL in EGFR-mediated Ras Signaling
- 주제(키워드) cancer , Ras signaling , apoptosis , Ras , Bcl-xL , EGF , EGFR , CBL , ubiquitination , phosphorylation , endocytosis , recycling
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 정선용
- 발행년도 2015
- 학위수여년월 2015. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000020412
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Ras 신호전달경로(Ras signaling pathway)는 EGF 등의 성장인자가 EGFR등의 수용체(receptor)에 결합되면 Ras가 활성화(GDP-Ras가 GTP-Ras로 변환)되고 이에 따른 순차적인 신호전달(signal transduction)에 의해 최종적으로 세포 생존 및 증식에 필요한 다양한 유전자들의 발현이 유도되는 매우 중요한 세포내 시스템이다. Ras 신호전달은 많은 종류의 암에서 과잉으로 활성화되어 있음이 알려져 있으며, 특히 다양한 암에서 EGFR과 Ras단백질이 과발현되어 있음이 밝혀졌다. 한편, 세포자멸사(apoptosis) 억제에 관여하는 대표적인 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질인 Bcl-xL 단백질은 다양한 종류의 암에서 과잉 발현되어 있으며, Ras 신호전달이 과잉 활성화 되어 있는 세포에서도 과발현 되어 있음이 알려져 있다. 최근의 연구에서 Bcl-xL이 미토콘드리아(mitochondria)에서의 세포자멸사 조절 이외에도 세포질(cytosol)에서 세포주기(cell cycle), 세포분화(cell differentiation), 세포신호전달(signal transduction) 등에 영향을 끼쳐 암 발생 및 전개를 촉진시키는 것으로 보고되었다. 이에, 본 연구에서는 Ras 가 과잉 활성화된 암세포에서 Ras신호전달경로와Bcl-xL단백질의 연관성을 연구하고자 하였다. 먼저, 본 연구에서 사용한 K-, H-, N-Ras 가 활성화된 세 종류의 암 세포주(HCT116, T24, HT1080)에 EGF를 처리하거나 EGFR을 과발현 시킨 후Bcl-xL의 발현량의 변화를 조사한 결과, 세 종류의 세포 모두에서 Bcl-xL의 발현량이 증가되었음을 확인함으로써, 이들 세포에서Bcl-xL이 Ras 신호전달경로의 타깃 유전자임을 확인하였다. 다음으로, 세 종류의 세포주에 Bcl-xL 을 과발현(overexpression) 하거나 RNA interferenc에 의해 Bcl-xL을 knockdown 한 실험 결과, EGFR의 활성화(인산화된 EGFR)와 Ras의 활성화(GTP-Ras)가 Bcl-xL의존적으로 조절 된다는 새로운 사실을 밝혔다. 특히, Bcl-xL knockdown 한 세포에서는 EGF의 첨가에도 불구하고 EGFR과 Ras 의 활성이 증가 되지 않았다. 이러한 결과는 EGF/EGFR/Ras 신호전달 경로에 있어서 Bcl-xL이 필수적이며, Bcl-xL이 Ras 신호전달 경로의 최 상위에 있는 EGFR의 활성 조절에 관여한다는 사실을 시사하였다. 한편, EGFR과 Ras가 과잉 활성화된 많은 종류의 암세포에서 혈관형성(angiogenesis)인자들이 증가되어 있음이 잘 알려져 있다. 이에Bcl-xL이 혈관형성에 관여하는지 조사하였다. HCT116세포에 Bcl-xL을 과발현 시키거나 발현억제 시킨 후 혈관형성인자들의 발현변화를 조사하였다. 그 결과 대표적 혈관형성인자인 VEGF, angiogenin, CXCL16, HB-EGF등의 발현량이 Bcl-xL의 발현량과 연계되어 있다는 사실을 밝혔다. 이러한 결과는, Bcl-xL의 과발현이 EGFR의 활성화를 유도하고, 이로 인해 다양한 혈관형성인자의 발현을 증가시켜 암 전개에 영향을 미친다는 사실을 시사한다. Bcl-xL의 과발현에 따른 EGFR의 인산화의 증가는 EGF 처리 시에 더욱 뚜렷이 나타나고 지속되었으며, 이때 EGFR 단백질의 양도 증가되었다. 이러한 EGFR 단백질의 증가가 전사조절(transcriptional regulation)에 기인 하였는지 밝히기 위하여EGFR mRNA의 발현량을 확인한 결과 전사조절과는 관련이 없는 것으로 확인되었다. 인산화에 의해 활성화된 EGFR은 유비퀴친화(ubiquitination)가 일어나고, 세포내이입(endocytosis) 과정을 통해 세포내로 이동하게 되고, 그 다음 과정으로 프로테오솜(preoteosome)에서 분해되거나 재순환(recycling) 되어 다시 세포막에서 재활용되게 된다. Bcl-xL이 EGFR의 세포내 이입에 영향을 끼치는지에 대해 조사한 결과, Bcl-xL 과발현 세포에서 EGFR의 내재화(internalization)가 크게 증가되는 것을 관찰하였다. EGFR 의 Lys-63-linked 유비퀴틴은 재순환이, Lys-48-linked 유비퀴틴은 프로테오솜 분해가 유도된다. 다음으로, Bcl-xL 과발현에 따른 EGFR 의 양적 증가가 Lys-63-linked 유비퀴틴 증가에 의한 EGFR 재활용 증가에 기인 하였는지 조사하였다. Bcl-xL 과발현 세포에서 EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴이 증가되었으며, 반대로 Bcl-xL knockdown 세포에서는 EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴이 감소되었다. 상기 결과들을 종합하면, Bcl-xL의 과발현은 Ras 신호전달경로의 최상위에 있는 EGFR의 인산화를 증가시키고, 이로 인해 세포내의 EGFR의 Lys-63-linked 유비퀴틴의 증가와 EGFR의 세포내이입이 증가되고, EGFR 재순환의 증가에 의해 세포막에 존재하는 EGFR의 양이 계속 유지되어, 결과적으로 Ras 신호전달경로의 활성화가 지속되는 것으로 설명할 수 있을 것이다. CBL은 EGFR의 대표적 E3-ubiquitin ligase로 알려져 있다. Bcl-xL이 CBL-매개의 EGFR 인산화와 유비퀴틴화에 어떤 영향을 끼치는지 조사하였다. Bcl-xL이 과발현된 세포에서 CBL과 EGFR의 결합(binding)이 증가되고 지속되었으며, 또한 EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴이 증가되었다. 하지만, CBL 발현억제 세포에서는 Bcl-xL의 과발현 시에도 EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴이 증가되지 않았다. 이러한 결과는 Bcl-xL에 의한 EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴의 증가는 CBL 의존적임을 시사한다. 즉, Bcl-xL 과발현은 CBL과 EGFR의 결합을 증가시키고, 이로 인해 EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴이 증가되어 EGFR의 재순환이 촉진됨으로써, 결과적으로 Ras 신호전달경로의 활성화가 유도되었음을 시사한다. Bcl-xL에 의한 CBL과 EGFR의 결합의 증가 원인을 찾기 위하여 Bcl-xL과 CBL 연관성을 조사한 결과, Bcl-xL이 CBL과 결합한다는 새로운 사실을 밝혔다. Bcl-xL은 주로 미토콘드리아 외막(outer-membrane)에 존재하고 CBL은 세포질에 존재하기 때문에 이 두 단백질들이 어디에서 결합하는지 조사하였다. EGF 처리 시에 미토콘드리아에 존재하는 Bcl-xL의 양이 감소하고 세포질에 존재하는 Bcl-xL의 양이 증가된 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 미토콘드리아에 위치하는Bcl-xL이EGF 처리에 의해 세포질로의 이동이 촉진되었고, 그 결과로서 CBL과의 결합이 증가되었음을 시사한다. Bcl-xL과 CBL의 결합에 대한 명확한 규명을 위하여 Bcl-xL BH3-domain부위에 돌연변이(mutation)를 가진 Bcl-xL Y101K과 Bcl-xL G138A의 두 가지 돌연변이체(mutant)를 사용하였다. 두 가지 돌연변이 Bcl-xL모두 야생형(wild type) Bcl-xL에 비해 CBL과 약한 결합력을 나타내었다. 또한, 야생형Bcl-xL의 과발현 세포에 비해 두 가지 돌연변이 Bcl-xL이 과발현된 세포에서는, EGFR인산화, EGFR Lys-63-linked 유비퀴틴, Ras 활성화가 적다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 결과는, Bcl-xL의 BH3-domain부위가 CBL과의 결합에 중요하고, Bcl-xL 은CBL과의 결합을 통해 Ras 신호전달에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 본 연구의 결과로서, 암세포에서 과발현된 Bcl-xL은 CBL과 결합하여 CBL과 EGFR의 결합을 촉진하고, 이로 인해 EGFR의 Lys-63-linked 유비퀴틴화, 인산화, 세포내이입, 재순환이 증가됨으로써 결과적으로 Ras 신호전달이 활성화된다는 새로운 사실을 밝혔다. 즉, Ras 신호전달경로의 하류(downstream)에 있는 Bcl-xL이 상류(upstream)에 있는 EGFR의 활성을 피드백 조절(feedback regulation)한다는 새로운 신호전달경로 모델을 제시하였다. 결론적으로, 본 연구에서 EGFR-매개의 Ras 신호전달에 관여하는 Bcl-xL의 새로운 기능을 밝혔다. 본 연구의 결과가 Bcl-xL이 과발현되고 Ras신호전달이 과잉 활성화된 많은 종류의 암에 대한 새로운 치료법 개발에 도움이 될 수 있기를 기대한다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
II. MATERIALS AND METHODS 12
1. Reagents & antibodies 12
2. Cell culture and transfection 12
3. Stable cell line construction 12
4. Immunoblotting and immunoprecipitation 13
5. Plasmid constructs and siRNAs 13
6. Ras activation assay 14
7. Reverse transcription PCR (RT-PCR) and real-time RT-PCR 14
8. Human angiogenesis protein array 14
9. Biotinylation assay 15
10. Immunofluorescence and confocal microscopy 15
11. EGFR Internalization Analysis 16
III. RESULTS 17
1. The Bcl-xL as a downstream target of the EGF/EGFR-mediated Ras signaling 17
2. Involvement of Bcl-xL in the regulation of Ras signaling 19
3. Involvement of Bcl-xL in the activation of EGFR at the beginning of the EGFR-mediated Ras signaling pathway 23
4. Bcl-xL-mediated modulation of EGFR levels during EGF stimulation 29
5. Correlation between Bcl-xL level and the expression level of angiogenesis promoting
factors in Ras-activated cancer cells 35
6. Bcl-xL-mediated enhancement of EGFR endocytosis during EGF stimulation 38
7. Bcl-xL-mediated enhancement of EGFR ubiquitination and interaction between
EGFR and CBL during EGF stimulation 44
8. Binding of Bcl-xL to CBL and enhancement of their interaction by EGF stimulation
52
9. Importance of the BH3 domain of Bcl-xL in binding to CBL and thereby EGFR
ubiquitination 56
IV. DISCUSSION 59
V. CONCLUSION 68
REFERENCES 69
국문요약 80
