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자가저해 개념을 이용한 베타-락타마제 자이모겐의 디자인

Design of Beta-lactamase zymogens using the concept of autoinhibition

초록/요약

본 연구에서는 단백질활성조절 메카니즘의 하나인 자가저해컨셉트를 이용하여 베타락타마제지모겐을 개발하였다. 지모겐이란 비활성상태인 전구체로서 지모겐의 펩 티드결합이 단백질가수분해효소에 의해 가수분해가 되면 활 성을 갖는 형태로 전환이 되는 효소를 말한다. 지모겐의 활 성화된 효소로의 전환은 매우 다양한 생물학적인 현상을 조 절함에 있어서 중요한 역할을 한다. 또한 생물학적 중요성 이외에 본래 형태의 지모겐이나 특별히 변형한 지모겐은 잠 재적으로 센서로서의 개발에 이용되거나 합성 신호 전달 연 속반응에 구성성분으로서 적용될 수 있다. 지모겐의 펩티드 결합이 잘리면서 활성화되는 것을 이용하여 본래 형태의 지 모겐이나 변형된 형태의 지모겐으로 프로테아제의 활성을 측정하는 방법들이 개발되어 왔다. 자가저해단백질은 활성을 갖고 있는 도메인과 활성 부위를 억제하는 폴리펩타이드인 유사기질로 이루어져있으며 이 두 도메인은 분자 내 상호작용을 통해서 서로 상호작용 한다. 자가저해단백질은 분자 내 상호작용으로 인해 엔트로 피측면에서 유리하기 때문에 억제도메인과 활성 도메인의 친화도가 낮을 때에도 낮은 활성을 갖는다. 자가저해단백질 은 억제도메인이 모디피케이션을 통해서 제거가 되거나 다 른 분자들에 붙거나 또는 활성 도메인과 억제도메인사이의 연결부위가 잘리면서 활성화될 수 있다. 이러한 자가저해 디 자인은 단백질스위치에 적용할 수 있다. 단백질 절단에 의해 활성화되는 자가저해효소는 지모겐의 한 종류로 볼 수 있는 데 이것은 하나의 효소와 이 효소의 억제자 이 두 부분을 프로테아제가 인식하여 자를 수 있는 부분을 포함한 링커로 연결하여 융합시켜서 만들 수 있다. 본 연구에서는 베타-락타마제 효소와 억제단백질인 BLIP을 프로테아제가 인식하여 자르는 부위를 포함한 링커 를 통해 두 부분을 융합하여 자가저해 베타-락타마제 효소 를 만들었다. 더욱이, 자가저해 단백질은 프로테아제에 의해 활성화되므로 개발한 지모겐을 이용하여 프로테아제 활성측 정방법으로 사용할 수 있다 정상적이지 않은 프로테아제의 활성은 다양한 질병과 관련이 있으므로 생체의학연구에 앞 서 말한 프로테아제 측정방법을 활용 할 수 있다. 덧붙여 센서로서의 베타-락타마제 지모겐의 이점은 다양한 발색작용 을 하는 베타-락타마제의 기질을 이용 할 수 있다는 것이다. 따라서 이 베타-락타마제 지모겐이 활성화된 형태가 되면 충분히 측정할 수 있는 신호를 생성해낼 수 있다. 이번 연구에서 우리는 프로테아제에 의해 활성화될 수 있는 자가저해 베타-락타마제 효소를 개발하였으며 이 효소는 높은 민감도를 가지는 프로테아제 측정 센서로 이용 될 수 있음을 밝혔다. 개발된 지모겐은 프로테아제에 의해 활성화되며, 활성화된 지모겐에 의해 발생한 증폭된 흡광도 신호를 이용해 민감도가 높은 프로테아제 측정방법을 개발 하였다. 또한 이러한 접근을 통해 개발된 지모겐을 생물학적 센서나 합성신호전달체계의 요소로서 적용시킬 수 있다.

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목차

Introduction 1
Materials and Methods 9
Plasmid construction 9
Expression and purification of proteins 11
Enzyme kinetics 12
MMP2 activity assay 13
Results 14
Constructions and kinetic characteristics of beta-lactamase zymoge 14
Optimization of beta-lactamase zymogens 21
Enzyme activity of the most outstanding candidate for MMP-2 assay 22
Discussion 25
Notes and references 28
Abstract in Korean 31

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