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기관지 천식 환자의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리한 유전자를 이용한 재조합 인간 자가항체 개발 및 기능 검증

Development and characterization of recombinant human autoantibody using cDNA made from peripheral blood mononuclear cells of patients with bronchial asthma

초록/요약

목적 : 현재 비알레르기성 천식의 발병기전은 아직 명확하게 규명되지 못한 상태이다. 최근 비알레르기성 천식의 병인기전에 자가면역 기전이 관여할 가능성이 제시된 바 있으며 최근 기도상피세포의 주요 세포골격 구성 단백 질인cytokeratin 18(이하 CK-18) 단백질이 비알레르기성 천식 환자의 혈청 IgG 자가항체와 반응하는 주요 기도상피세포 자가항원 단백질임이 보고된 바 있다. 또한 비알레르기성 천식 환자의 혈액으로부터 분리된 전체IgG 자가항체가 배양된 기도상피세포에 대해 독성반응을 나타냄이 보고되었다. 이에 기도상피 세포 단백질 항원인 CK-18단백질에 대한 자가항체가 비알레르기성 천식의 병인기전에 관여할 가능성을 확인해보고자 본 연구를 시행하였다. 본 연구에서는 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리한 유전자를 이용하여 재조합 자가항체를 개발 및 제조하고 이를 이용하여 자가항체에 의한 기도상피세포 독성을 분석하고자 하였다. 재료 및 방법 : CK-18단백질에 대한 IgG 자가항체가 고역가로 검출되는 11명의 성인 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액 단핵구 세포로부터 total RNA를 분리하였다. 이를 이용하여 인간 항체 유전자 cDNA library를 구축하였고 phage-display방법을 이용하여 CK-18단백질에 대해 높은 항원반응 강도를 나타내는 유전자 재조합 자가항체들을 선별하여 single-chain variable fragment (scFv)와 IgG 형태로 생산 및 정제하였다. 최종적으로 분리된 인간 유전자 재조합 단클론 자가항체들은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot, immunofluore- scence를 통해 항원 반응성상을 분석하였으며3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphen yl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay 방법을 이용하여 배양된 기도상피세포주 (A549)에 대한 세포독성을 분석하였다. 결과 : 1. ELISA와 immunoblot, immunofluorescence를 이용한 항원반응 분석결과 양성 단클론 IgG 자가항체들은 CK-18단백질과 선택적으로 반응하였다. 특히 immunofluorescence staining 결과 양성 단클론 IgG 자가항체들의 사람 기도상피 세포주(A549)에 대한 반응양상은 CK-18단백질에 대한 마우스 단클론 항체의 반응양상과 일치하였다. 2. 세포독성 실험에서 양성 단클론 IgG 자가항체들은 음성 단클론 대조항체들에 비해 주요 세포골격 구성 단백질인CK-18단백질이 발현되는 사람 기도상피 세포주(A549)에 대해 유의하게 높은 세포독성을 나타내었다 (p < 0.05). 3. 양성 단클론 IgG 자가항체와 건강한 사람의 신선한 혈청으로부터 얻은 보체를 함께 처리하였을 경우 가열에 의해서 보체를 불활성화시킨 사람 혈청을 첨가한 경우에 비해서 세포독성이 유의하게 높음을 확인할 수 있었다 (p < 0.05). 4. 양성 단클론 IgG 자가항체의 기도상피세포에 대한 세포독성 기전을 annexin-v와 propidium iodide (PI) 염색을 이용한 flow cytometry 결과 양성 단클론 IgG 자가항체는 직접적으로 기도상피세포의 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다. 결론 : CK-18단백질에 대한 인간 유전자 재조합 단클론 자가항체들은 기도상피 세포에 대하여 직접적인 세포독성을 나타내었으며, 보체 첨가시 자가항체에 의한 세포독성이 증가되었다. 이러한 결과들은 비알레르기성 천식환자의 혈액에 존재하는 기도상피세포 자가항원인 CK-18단백질에 대한 IgG 자가항체가 기도상피세포 독성과 보체활성화를 유도하여 비알레르기성 천식의 병인기전에 관여할 가능성을 시사한다.

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목차

국문요약 ⅰ
차례 ⅲ
그림차례 vi
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 3
A. 대상 환자의 선별 및 채혈 3
1. 대상 환자 및 비알레르기성 천식의 임상적인 중증도 분류 3
B. 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액으로부터 total RNA 추출 3
1. 말초혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 분리 3
2. Total RNA 추출 4
3. mRNA 분리 4
C. Polymerase chain reaction (PCR)을 이용한 cytokeratin 18 (CK-18) 단백질에 대한 인간 single-chain variable fragment (scFv) 항체 라이브러리의 구축 5
1. cDNA 합성과 중합효소 연쇄반응 (PCR) 5
2. scFv의 heavy chain과 light chain 합성 5
3. Overlapping PCR을 통한 인간재조합 scFv의 제작 5
4. Ligation 6
5. Library transformation 6
D. CK-18 단백질에 결합하는 scFv항체의 선별 분리 7
1. Panning 7
2. Phage ELISA를 통한 CK-18 단백질 특이 scFv의 선별 8
3. scFv정제를 위한 subcloning 9
4. scFv 단백질 정제 10
E. 선별된 scFv항체의 CK-18 단백질에 대한 반응 평가 11
1. Sodiumdodecylsµlfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 와 immunoblot 11
2. 정제된 scFv항체들을 이용한 ELISA 11
F. 인간 유전자 재조합 단클론 IgG 자가항체의 제작 및 정제 12
1. IgG 자가항체의 제작 12
2. IgG 자가항체 생산을 위한 세포배양 12
3. Protein A column을 이용한 IgG 자가항체의 정제 13
G. IgG 자가항체의 CK-18 단백질에 대한 반응 평가 13
1. IgG 자가항체를 이용한 항원 반응특성의 ELISA 13
2. Immunoblot 분석 14
3. Immunofluorescence analysis 14
4. Flow cytometry 분석 15
H. IgG 자가항체의 세포독성 평가 및 세포사멸 기전 관찰 15
1. 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay 15
2. 사람 보체 첨가시 자가항체에 의한 세포독성의 변화 분석 16
3. Annexin V-FITC / propidium iodide (PI) assay를 이용한 세포사멸기전 분석 16
Ⅲ. 결과 18
A. 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액단핵구 (PBMC)로 부터 추출한 total RNA 18
B. 인간 유전자 재조합 단클론 scFv자가항체들과 인간 유전자 재조합 단클론 IgG자가항체들의 정제 및 SDS-PAGE 18
C. Immunoblot을 통한 CK-18 단백질에 대한 단클론 IgG자가항체의 반응 확인 19
D. ELISA를 이용한 CK-18 단백질에 대한 양성 단클론 scFv자가항체와 양성 단클론 IgG 자가항체의 반응 확인 20
E. Immunofluorescence 분석을 통한 IgG 자가항체의 A549 세포에 대한 반응 23
F. Flow cytometry를 이용한 IgG 자가항체의 A549 세포에 대한 항원반응 측정 24
G. A549세포에 대한 인간 유전자 재조합 단클론 IgG 자가항체의 세포 독성 측정 25
H. Flow cytometry를 통한 세포독성기전 분석 결과 29
Ⅳ. 고찰 31
Ⅴ. 결론 37
참고문헌 38
ABSTRACT 41
그림 차례

Fig. 1. Electrophoresis of total RNA extracted from peripheral blood mononuclear cell (PBMC) of patients with nonallegic asthma 18

Fig. 2. Protein staining of purified human recombinant scFv antibodies 19

Fig. 3. Protein staining of purified human recombinant IgG antibodies. 19

Fig. 4. Immunoblot analysis of human recombinant IgG monoclonal antibodies to CK-18. 20

Fig. 5. ELISA of binding activity of human recombinant scFv antibodies to CK-18 21

Fig. 6. Binding activity of human recombinant IgG monoclonal antibodies to CK-18 analyzed by ELISA. 22

Fig. 7. Immunoflorescence analysis of the binding of human recombinant IgG monoclonal antibodies to A549 and HaCaT. 23

Fig. 8. Flow cytometry of binding affinity of human recombinant IgG monoclonal antibodies with surface of A549. 24

Fig. 9. Analysis of antibody-dependent cytotoxicity to A549 cell induced by human recombinant IgG monoclonal antibodies to CK-18. 27

Fig. 10. Analysis of antibody-dependent cytotoxicity to HaCaT induced by human recombinant IgG monoclonal antibodies to CK-18. 28

Fig. 11. Flow cytometry analysis of apoptosis of A549 induced by human recombinant IgG antibodies to CK-18 30

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