Diisocyanate 유발 직업성 천식에서 MBL2 유전자 다형성 연구
Genetic Effect of MBL2 Polymorphisms in Patients with Diisocyanate-induced Occupational Asthma
- 주제(키워드) Genetic polymorphism , isocyanate , MBL2 , occupational asthma
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 박해심
- 발행년도 2013
- 학위수여년월 2013. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000014739
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
-ABSTRACT- Genetic Effect of MBL2 Polymorphisms in Patients with Diisocyanate-induced Occupational Asthma Background and Objective: Diisocyanate (DI) is the most common cause of occupational asthma (OA) in Korea. Although various mechanisms were involved in the pathogenesis of DI-OA, oxidative stress has been suggested as a potential mechanism, which leads to the formation of a complement-activating mannose-binding lectin (MBL) ligand on human endothelial cells. MBL initiates the lectin complement activation pathway following oxidative stress and generate complement cascade, which is involved in chronic airway inflammation. Materials and Methods: To demonstrate genetic association of MBL2 polymorphisms in DI-OA, 99 patients with DI-OA, 99 asymptomatic exposed controls (AEC) and 144 unexposed normal controls were enrolled. Three polymorphisms (-554 G>C, -431 A>C and -225 G>C) in the MBL2 promoter were genotyped by TaqMan allelic discrimination assays using TaqMan probes. The serum MBL levels were detected using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The functional variabilities of the promoter polymorphisms were analyzed by luciferase reporter assay and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Result: Significantly higher frequency of the AA genotype at -431 A>C (P=0.016) and higher frequency of haplotype (ht) 2 [CAG] were noted in the DI-OA group compared to AEC group (P=0.044). DI-OA patients carrying the GG genotype at -225 G>C, and ht2 [CAG] had significantly lower PC20 methacholine levels (P=0.030, and P<0.001, respectively) than non-carriers. Serum MBL levels were significantly higher in DI-exposed subjects (including both DI-OA and AEC) carrying the GG genotype of -554 G>C and/or -225 G>C than those of other genotypes (P=0.004 and P=0.010, respectively). The DI-OA exposed subjects carrying ht1 [GAG] showed higher serum MBL levels (P=0.004), while the subjects carrying ht3 [CAC] had significantly lower serum MBL levels (P=0.020) than those with others. The luciferase activity was enhanced significantly in the construct containing -554G compared to the -554C in human hepatocarcinoma cell (Hep3B) (P=0.002). EMSA showed that a -554G probe produced a specific shifted band compared to a -554C probe. Conclusion: These findings suggest that MBL2 ht2 [CAG] was significantly associated with the phenotype of DI-OA and MBL2 polymorphism at -554 G>C affects serum MBL levels via increased promoter activity in DI-exposed subjects. Key words: Genetic polymorphism, isocyanate, MBL2, occupational asthma
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TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ⅰ
TABLE OF CONTENTS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ⅲ
LIST OF FIGURES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• Ⅴ
LIST OF TABLES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ⅵ
ABBREVIATION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ⅶ
Ⅰ. INTRODUCTION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
A. Genetic association study of MBL2••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
1. Study subjects •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
2. Diisocyanate-bronchial challenge test ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
3. Serum specific IgG and IgE antibodies to DI-human serum albumin conjugate
determined by enzyme-linked immunosorbent assay •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6
4. Single nucleotide polymorphism identification and genotyping ••••••••••••••••••••••••••••••••• 7
5. Measurement of human serum MBL levels ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
6. Statistical analysis ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
B. Functional study of MBL2 genetic polymorphisms •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10
1. Cell culture •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10
2. MBL2 mRNA expression in various cell lines •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3. Plasmid construction and luciferase reporter assay ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 13
4. Nuclear extract preparation and electrophoretic mobility shift assay •••••••••••••••••••••• 15
Ⅲ. RESULTS••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
A. Genetic association study of MBL2••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
1. Clinical characteristics of the study subjects ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
2. Genotype frequencies of the MBL2 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3. Haplotype frequencies of the MBL2 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
4. PC20 methacholine levels according to genotype and haplotype of MBL2 in diisocyanate-induced occupational asthma patients •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24
5. Serum MBL levels according to the MBL2 polymorphisms ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25
B. In vitro functional studies for MBL2 polymorphisms ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 27
1. Endogenous expression of MBL2 from various cell lines •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 27
2. Effect ot MBL2 haplotypes on transcriptional activity •••••••••••••••••••••••••••••••• 28
3. Electrophoretic mobility shift assay •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 30
Ⅳ. DISCUSSION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 32
Ⅴ. CONCLUSION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••36
Ⅵ. REFERENCES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••37
국문요약 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••43
