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미토콘드리아 내 황화수소 검출에 적합한 이광자 가변색 표지자의 합성 및 생체영상

Two-Photon Fluorescent Probes for Ratiometric Detection of Mitochondrial Hydrogen Sulfide in Living Tissues

초록/요약

논문요약 (Abstract) 황화물의 일종인 황화수소는 계란 썩은 냄새 비슷한 악취가 나고 무색인 가스 형태로서 우리에겐 대기오염 이나 온실효과의 주범 혹은 독가스로 인식되어 왔다. 하지만 최근 연구 결과 황화수소는 체내에서 생성되는 3rd gas transmitter 의 하나로서 신호전달 및 세포 면역 시스템에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 황화수소의 검출은 다양한 생명 현상 연구에 크게 기여할 수 있을 것이다. 하지만 기존에 소개된 황화수소 검출이 가능한 표지자들은 일광자 형광에 최적화 되어있어서 현실적으로 유저들이 실질적인 연구를 하는 데 제한적인 부분이 많았다. 이에 반해 이광자 형광 시스템을 이용한 본 연구의 경우 시료 손상을 최소화하면서, 시료의 깊은 곳까지 관찰을 할 수 있을 뿐 아니라 원하는 만큼의 깊이 별 관찰이 가능하며, 세포 및 조직의 자가형광 유발을 최소화 할 수 있는 이광자 형광의 장점을 모두 살려 실질적인 생명현상 관찰에 최적화 할 수 있었다. 특히 기존에 소개된 표지자들은 세포의 cytosol 내의 황화수소 검출 및 혈액의 plasma 내 황화수소 검출에 제한적 이였지만 본 연구는 전체 황화물의 30 %가 저장되어 있으며 세포면역, 에너지생성 등 황화수소의 다양한 역할이 이루어지는 미토콘드리아 내 황화수소 검출을 가능하게끔 하여 다양한 생명현상 관찰 기여 및 관련 연구에 획기적인 효과가 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구는 가변색 표지자의 특징적 장점으로 황화수소 농도까지 검출이 가능하게 하여 정량적인 연구에도 기여하는 한편, 황화수소 농도가 Down syndrome, Alzheimer’s disease (AD) 및 Parkinson's disease (PD) 등 다양한 질병의 척도가 된다는 최근 연구 결과들과 맞물려 질병의 조기 진단에도 큰 역할을 할 수 있을 것이라 기대된다.

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목차

차 례

논문요약 ⅲ
본문차례 ⅳ
그림차례 ⅵ
표 차례 xi
Ⅰ. 서론 1
1. 이광자 형광 및 표지자의 소개 1
2. 생체 내 황화수소 3
(1) 황화수소의 역할 3
(2) 미토콘드리아 내 황화수소의 생성 3
(3) 미토콘드리아 내 황화수소의 역할 4
(4) 미토콘드리아 내 황화수소 검출 표지자의 필요성 5
3. 감응 메커니즘: Internal Charge Transfer (ICT)
system 7
4. Azide 작용기와 황화수소 간의 반응 mechanism 8
Ⅱ. 본론 9
1. SHS-M1 및 SHS-M2의 합성 9
(1) 형광체(1 & 2)의 합성 9
(2) Receptor의 합성 18
(3) SHS-M1 & SHS-M2의 합성 19
2. Photophysical properties of SHS-M1 & SHS-M2 22
(1) 표지자의 물에 대한 용해도 측정 (Water solubility) 22
(2) LC/MS 분석을 통한 표지자의 반응 전 후 물질
분석 24
(3) 용매에 따른 형광 파장의 변화 측정 및 비교
(Solvent dependency) 26
(4) 일정 농도의 황화수소 하, 시간의 변화에 따른
Fluorescence intensity 변화 측정 및 비교
(Time dependency) 28
(5) H2S 의 농도에 따른 표지자의 감응도
(Detection limit) 30
(6) H2S에 감응하는 표지자의 속도 상수 (kobs test) 32
(7) 반응 차수의 측정 (k2 -value test) 33
(8) 표지자의 감응 선택성 실험 (Selectivity test) 34
(9) 표지자의 수소이온 농도 의존성 실험
(pH dependency) 36
(10) 표지자의 Buffer와 cell에서의 이광자 형광효율
(δΦ/GM) 비교 38
3. SHS-M1 & SHS-M2를 이용한 Two-photon
Microscopy Bio-imaging 40
(1) 표지자의 광 안정성 실험 (photo stability test) 40
(2) 표지자의 세포 내 씻어 내림 정도 실험
(wash out test) 41
(3) 표지자의 세포 내 독성도 실험 (viability test) 43
(4) 표지자의 세포 내 미토콘드리아 겹침 정도 실험
(co-localization test) 45
(5) SHS-M2의 세포 내 two-photon fluorescence
spectra test 46
(6) SHS-M2의 exogenous H2S source에 의한
cell-imaging 48
(7) SHS-M2의 endogenous H2S source에 의한
cell-imaging 49
(8) SHS-M2의 endogenous H2S source에 의한
cell-imaging 51
(green window/red window/merged image)
(9) SHS-M2의 endogenous H2S source에 의한
tissue-imaging 52
(10) SHS-M2의 endogenous H2S source에 의한
tissue-imaging 54
(green window/red window/merged image)
Ⅲ. 결론 56
Ⅳ. 참고문헌 57
Spectrum 58

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