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조직공학을 이용한 기관연골조직 제작과 생체이식 후 조직학적 변화 및 기능적평가 : 생체동물실험

Radiologic, Histologic and Functional Evaluation after Implantation of Cultured Trachea Allograft : in vivo study

초록/요약

- 국문요약 - 조직공학을 이용한 기관연골조직제작과 생체이식 후 조직학적 변화 및 기능적 평가: 생체동물실험 배경: 일반적으로 알려진 기도재건의 방법은 단단 문합, 자가연골이식, 국소피판 혹은 유리피판 등으로 다양하다. 협착부위 제거 후 단단 문합이 가능하다면 가장 이상적인 치료방법이겠으나, 모든 환자에서 단단 문합술이 적용 가능한 것은 아니다. 단단 문합이 불가능한 기도협착을 성공적으로 치료하기 위해서는 협착 부위를 충분히 제거하고 그로 인해 발생 되는 기관의 결손 부위를 원할 하게 재건해야 할 것이다. 결손 부위를 재건 하기 위해서는 일반적으로 연골이나 피판술 등 자가조직이 사용되나, 이에는 한계가 있어 새로운 기관 재건물 및 주입물을 이용하고자 하는 시도가 있어 왔다. 하지만 이러한 경우 재건 및 주입 후에 지속시간이 짧아서 추가적인 처치과정이 필요하고, 이식물의 소실이나 면역반응에 의한 염증으로 합병증 등이 발생할 수 있다. 기관이식물의 경우, 연골의 재생과 아울러 재건 부위의 점막 재생이 신속하고 원할 하게 이루어지도록 하는 것이 가장 중요하다. 따라서 새로운 기관 재건물이나 주입물에 관한 연구가 지속되고 있다. 목적: 본 연구에서는 돼지연골의 세포 외 기질을 사용하여 제작한 다공성 지지체와 배양된 동종 연골 세포를 토끼 기관에 이식하여 기관 재건의 가능성을 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: 돼지 연골을 탈 세포와 분쇄과정을 통하여 분말 형태로 제작 후 압축, 가교, 염 추출법을 통하여 3차원의 PCSs (Porcine Cartilage derived Substance Scaffold)를 직경 12mm, 높이 5mm로 제작하였다. 제작한 지지체에 동종 새끼토끼의 무릎에서 분리한 연골세포 (1x106cells/scaffold)를 접종하여 이식에 적합한 강도와 조직의 특성을 부여하고자 7주간 배양하였다. 배양된 지지체는 성인 토끼의 4 mm x 6 mm (직경 x 높이) 기관 결손 부위에 이식되었으며, 2주, 1개월, 2개월 후 육안적, 조직학적, 영상학적, 기능학적 관찰을 시행하였다. 결과: 제작한 PCS지지체의 물리학적 특성을 관찰한 결과, 공극의 크기는 250~350um로 확인 되었고, 공극률은 82%로 확인되었다. Live/Dead viability assay를 시행한 결과 지지체 내부의 세포는 90%이상 생존하고 있었다. 지지체를 육안적으로 확인한 결과 1주에는 본래의 형태가 유지되었고, 2주와 4주에는 점도 물질의 생성과 미끄러운 특성을 확인할 수 있었다. 이식 후 2주 내시경 관찰 결과 결손 된 부분에 이식된 지지체의 이탈이나 변형은 관찰되지 않았다. 이식 후 1개월에는 지지체의 일부가 기관 내부 쪽으로 육아조직을 형성한 것을 확인할 수 있었다. 이식 후 2개월에는, 1개월에 발견되었던 육아조직은 발견되지 않았고, 기관 내부의 점막이 재생되어 결손부위 및 지지체의 경계는 명확히 관찰되지 않았다. 이식 후 2주 H&E 염색결과에서 보면, 이식 초기는 이식된 연골세포 의하여 세포 외 기질이 생성되고, 중기에는 세포 외 기질 주변으로 대식 세포들이 부착되고 염증반응에 의해 육아조직이 형성되나, 말기에는 생성된 세포 외 기질이 성숙 되면서 형성되었던 육아조직이 이탈되는 현상에 의한 것이라 생각된다. Safranin-O 염색을 시행한 결과 이식 후 시간이 경과함에 따라 세포 외 기질을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 섬모 운동성 측정 결과 정상섬모와 이식한 섬모의 움직임은 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었고, 시간이 지남에 따라 정상섬모와 유사하게 회복됨을 확인할 수 있었다. 결론: In vivo 실험을 통한 토끼에서 얻은 동종 연골세포의 배양 방법을 확립하고 기관절제 동물실험모델의 구축과 개선 및 기관 내에 관한 기술과 임상적 연구 및 적용에 필요한 기초자료가 될 것으로 판단된다. 핵심어: 기관, 조직공학, 기관재생, 연골세포, 상피세포 섬모운동, 세포 외 기질, 돼지연골세포 지지체

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목차

차 례

국문요약 i
차례 iii
그림 차례 v

Ⅰ. 서론 1

Ⅱ. 재료 및 방법 4
1. 연골분리 및 연골세포 배양 4
2. 지지체 제작과정 6
3. 지지체에 배양한 연골세포의 종류 8
4. Live/ Dead Viability 9
5. 연구모식도 11
6. 기술 및 이식 도식화 13
7. 토끼 기관결손 후 지지체 이식 15
8. 내시경 촬영 17
9. 표본 슬라이드 제작 19
10. 조직학적 검사 20
11. 상피세포 섬모운동측정 21

III. 결과 22
1. PCS 지지체 완성 22
2. 지지체에 연골세포 접종 24
3. 접종된 연골세포의 생존 26
4. 배양된 지지체의 육안적 관찰 28
5. 내시경 결과 30
6. 이식 부위의 육안적 형태관찰 31
7. Hematoxylin and Eosin stain 34
8. Safranin-O stain 36
9. 섬모운동성측정 38



Ⅳ. 고찰 40

Ⅴ. 결론 45

참고문헌 46

ABSTRACT 49

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목차

그림 차례

Fig. 1. Chondrocyte isolation and culture 5

Fig. 2. PCS (Porcine Cartilage derived Substance) scaffold manufacuturing 7

Fig. 3. Cell viability measurement process 10

Fig. 4. Experimental schedule 12

Fig. 5. Schematic of the technique described in this study 14

Fig. 6. Scaffold transplantation 16

Fig. 7. Endoscopic evaluation 18

Fig. 8. Characteristics of porous scaffolds 23

Fig. 9. Chondrocyte-scaffold implants 25

Fig. 10. Live & Dead assay 27

Fig. 11. Gross evaluation of neocartilage cultured in the chondrogenic media using rabbit chondrocytes 29

Fig. 12. Endoscopic findings of rabbit trachea 31

Fig. 13. Gross specimen of the implanted trachea 33

Fig. 14. Histological evaluation of tissue-engineered trachea with Hematoxylin and
Eosin staining 35

Fig. 15. Histological evaluation of neocartilage with safranin-O staining 37

Fig. 16. Measurement of trachea ciliary beat frequency 39

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