신소재 Retinoyl tetrapeptideamide 및 경피전달시스템 개발에 의한 주름개선 효과 향상
Enhanced anti-wrinkle effects by a new synthetic retinoyl tetrapeptideamide with a novel transdermal delivery system
- 주제(키워드) anti-wrinkle , nanoemulsion , tetrapeptideamide
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 변상요
- 발행년도 2012
- 학위수여년월 2012. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 응용생명공학과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000012277
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
비타민A 유도체와 Gly-Pro-X 또는 Gly-X-Hyp의 패턴을 갖는 콜라겐 시퀀스를 활용한 펩타이드의 강력한 주름 개선 효과를 복합화하는 기술을 개발하여 소재화 하고자 하는데에 본 실험의 목적이 있다. 또한 유효 물질을 피부 속으로 전달하는데에 있어서 나노에멀전은 이중 지질막으로 이루어진 세포간극을 통하여 또는 직접 세포를 관통하여 친수성 물질과 유용성 물질을 침투 시킬수 있는 강력한 성능을 나타낸다. 그러므로 펩타이드 형태의 단점을 극복하기 위하여 나노에멀전에 다른 코팅 물질로 봉입하여 세포 투과율을 증진 시키며 안정성을 향상 시키고자 하였다. 새로운 물질의 합성은 SPPS 합성 방법으로 Rink amide AM resin (100-200 mesh)에 Fmoc 제거를 해가며 순차적으로 아미노산을 coupling 하였고 마지막에 retinoic acid와 coupling하여 새로운 retinoyl tetrapeptideamide를 합성하였다. Retinoyl tetrapeptideamide의 활용을 위해 물질 안정성에 대해 살펴 보았으며 열에 안정성을 갖는 반면 일광에 분해가 있음을 확인 하였고 소재의 활용시 주의해야 할 것으로 생각된다. 또한 물질의 독성을 알아보기 위해 MTT Assay를 시행하였으며 retinoyl tetrapeptideamide는 10 μM의 농도까지 세포 생존을 보이는 것을 확인 하였으나 retinoic acid는 10 μM에서 cell viability가 68%까지 감소하여 새롭게 합성된 retinoyl tetrapeptideamide가 독성이 더 적은 것을 확인하였다. Collagen Type 1의 유전자 발현 시험은 human fibroblast cell에서 시험하였으며 Retinoyl tetrapeptideamide는 1 μM에서 약 20% 정도 증가하였고 5 μM에서는 약 36% 증가하여 Collagen Type I의 발현이 증가하지 않은 Retinoic acid 보다 우수한 결과를 얻었다. Retinoyl tetrapeptideamide의 경피흡수를 높이기 위해 새로운 형태의 nanoemulsion을 고안했으며 우수한 deformability를 갖는 GPC-SL nanoemulsion을 개발하였다. CLSM을 이용한 Skin penetration test에서 1 hr 30 min 후에는 GPC-SL nanoemulsions에 포집되었던 형광 물질이 진피층의 더 아래쪽에 분포하고 농도 세기도 더 많은 것으로 관찰되었다. Coenzyme Q10을 standard nanoemulsions와 GPC-SL nanoemulsions 각각 1% 씩 포집시킨 Franz diffusion cell test 결과를 살펴 보면 standard nanoemulsions에 비해 약 11.4 배의 경피 흡수 증가량을 나타냈다. 이로써 retinoyl tetrapeptideamide를 새로이 제작한 GPC-SL nanoemulsions에 포집 가능함을 확인하고 생체 피부 침투 가능성을 높였으며 따라서 더 적은양의 retinoyl tetrapeptideamide로도 더 우수한 주름 개선 효과를 줄 수 있을 것으로 판단된다.
more초록/요약
This study aims to develop a technology that can combine and materialize the powerful wrinkle-improving effects of vitamin A and peptides using a collagen sequence with the Gly-Pro-X or Gly-X-Hyp pattern. Also, in delivering effective materials through the skin, nanoemulsion can provide a powerful performance in delivering hydrophilic materials and effective materials by penetrating directly into the cells or through the intercellular space formed of a lipid bilayer. Therefore, in order to overcome the shortcoming of the peptide form, I aimed to enhance the stability and cell penetration by inserting another coating material in nanoemulsion. For the synthesis of the new material, this study used the SPPS (solid-phase peptide synthesis) method where Fmoc was removed from the resin after which amino acid and retinoic acid were coupled to synthesize a new retinoyl tetrapeptideamide. This study also investigated the material stability to utilize retinoyl tetrapeptideamide, and I verified that it is stable against heat while decomposing in sunlight which recommends caution when using the material. Also, in order to investigate the toxicity of the material, I conducted an MTT Assay and verified the intracellular survival of retinoyl tetrapeptideamide up to a concentration of 10 uM. However, retinoic acid's cell viability at 10 uM dropped by up to 68% indicating that the newly synthesized retinoyl tetrapeptideamide has a lower toxicity. The gene expression experiment for Collagen Type 1 was conducted in the human fibroblast cell where retinoyl tetrapeptideamide increased by approximately 20% at 1 μM and by approximately 36% at 5μM showing that the gene expression for Collagen Type 1 is better than when retinoic acid is used. The authors designed a new form of nanoemulsion to improve the transdermal delivery of retinoyl tetrapeptideamide and developed GPC-SL nanoemulsion that has excellent deformability. The fluorescent materials collected in GPC-SL nanoemulsion were distributed more in the deeper layer of the dermis and the concentration was higher after 1 hour and 30 minutes in the skin penetration test using CLSM. According to the Franz diffusion cell test where coenzyme Q10 standard nanoemulsion and GPC-SL nanoemulsion were collected 1% for each, the GPC-SL nanoemulsion showed an 11.4 times higher transdermal penetration compared to that of the standard nanoemulsion. Therefore, this study was able to verify that retinoyl tetrapeptideamide can be collected in the newly produced GPC-SL nanoemulsion and enhance transdermal penetration in the human body from which I conclude that I can provide better wrinkle-improving effects with a smaller amount of retinoyl tetrapeptideamide.
more목차
국문요약......................................................................ⅰ
목차............................................................................ⅲ
표 목록........................................................................ⅵ
그림 목록.................................................................... ⅶ
약어........................................................................... ⅹ
1. 서론..........................................................................1
1.1 합성 원재료 .............................................................1
1.1.1 레티노익산............................................................1
1.1.2 콜라겐 ..................................................................2
1.2 고체상 펩타이드 합성 (SPPS) .....................................4
1.2.1 Fmoc 과 Boc 비교 .................................................5
1.2.2 고체상 합성을 위한 레진류 .......................................6
1.2.3 Coupling 방법 .......................................................8
1.2.4 활성 에스테르류......................................................8
1.2.5 Coupling 시약류.....................................................9
1.2.6 Coupling 반응에서 HOBt의 역할.............................. 11
1.2.7 용매화와 용매류 .................................................. 12
1.2.8 Deprotection ....................................................... 13
1.2.9 레진 시험 ........................................................... 14
1.2.10 Fmoc 레진 cleavage 와 ...................................... 15
1.2.11 Cleavage를 위한 펩타이드 레진 처리..................... 16
1.2.12 TFA cleavage 와 deprotection.............................. 17
1.2.13 Ether 침전..........................................................19
1.3 나노에멀전..............................................................22
1.3.1 에멀전과 나노에멀전..............................................22
1.3.2 나노에멀전의 형성 ................................................24
1.3.3 나노에멀전의 분류.................................................28
1.3.4 나노에멀전의 제조.................................................33
1.3.5 나노에멀전의 특성 평가..........................................35
1.3.5.1 입도 분포 측정....................................................35
1.3.5.2 제타 전위...........................................................37
1.3.5.3 형태학적 분석.....................................................39
1.3.5.4 열분석...............................................................42
1.3.5.5 경피 약물 전달 시스템..........................................44
1.4 연구 목적................................................................49
2. 재료 및 방법 ............................................................52
2.1 재료......................................................................52
2.1.1 고체상 펩타이드 합성 ............................................52
2.1.2 나노에멀전...........................................................52
2.2 기기......................................................................53
2.3 고체상 펩타이드 합성 과정........................................54
2.4 Retinoyl tetrapeptideamide의 안정성 시험...................55
2.5 Retinoyl tetrapeptideamide의 유효성 시험...................57
2.5.1 Cell viability 시험..................................................58
2.5.3 콜라겐 합성 시험...................................................58
2.6 나노에멀전 .............................................................61
2.6.1 나노에멀전의 제조.................................................61
2.6.2 입도 분포 측정......................................................63
2.6.3 제타 전위.............................................................63
2.6.4 형태학적 분석.......................................................63
2.6.5 포집 효율.............................................................64
2.6.6 열분석.................................................................64
2.6.7 경피 흡수 시험......................................................65
2.6.8 Franz diffusion cell 시험........................................65
3. 결과........................................................................67
3.1 고체상 펩타이드 합성...............................................67
3.1.1 Retinoyl tetrapeptideamide의 정량 분석....................69
3.1.2 Retinoyl tetrapeptideamide의 안정성 시험.................73
3.2 Retinoyl tetrapeptideamide의 유효성 시험 ..................74
3.2.1 Cell viability 시험..................................................74
3.2.2 DPPH 시험...........................................................75
3.2.3 콜라겐 합성 시험...................................................76
3.3 나노에멀전의 제조....................................................79
3.3.1 입도 크기 분포 측정...............................................82
3.3.2 나노에멀전의 변형성 연구.......................................86
3.3.3 제타 전위.............................................................87
3.3.4 형태학적 분석.......................................................88
3.3.5 열분석.................................................................92
3.3.6 경피 흡수 시험......................................................96
3.3.7 Franz diffusion cell 시험........................................98
4. 토의........................................................................99
4.1 고체상 펩타이드 합성................................................99
4.2 새로운 고변형성 나노에멀전.....................................100
5. 결론.......................................................................103
6. 참고 문헌................................................................105
