카텝신 G 저해제인 beta-ketophosphonic acid의 항노화 효과 : The antiaging effects of beta-ketophosphonic acid as a cathepsin G inhibitor
초록/요약
피브로넥틴(Fibronectin, Fn)은 섬유아세포(fibroblast)와 콜라겐(collagen)의 부착을 매개하는 부착 단백질로 세포의 형태유지, 생존, 증식, 조직재생 과정에 중요한 역할을 담당한다. 그러나, Fn은 카텝신 G(cathepsin G)에 의해서 4~5개의 Fn fragments (Fn-frs)로 쉽게 분해되며, 이러한 분해산물들은 콜라겐 분해효소들(matrix metalloproteinase’s, MMPs)의 발현과 활성을 증가시킨다. 특히, 카텝신 G는 노인피부에서 발현이 증가되며, proMMP-1을 active MMP-1로 전환을 촉진시킨다는 것이 밝혀짐으로써 피부노화가 카텝신 G에 매개된 Fn-frs에 의해서 유발될 수 있음이 보고된 바 있다. 본 연구에서는 Fn-frs에 의한 피부노화 관련 유전자의 발현양상 및 카텝신 G 저해제의 항노화 효과 등을 확인하기 위하여, Fn-f70 (70 kDa Fn fragment)과 외인성 노화인자인 UVB (ultraviolet B)와의 유전자 발현변화에 대한 상관성 비교, 카텝신 G 저해제에 의한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 손상 억제능 및 자외선에 의한 항주름 효과를 조사하였다. 카텝신 G의 발현은 젊은이(5명 남자, 평균나이 33.5세) 엉덩이 피부에 UVB를 2 minimal erythma dose (MED) 조사한 후 카텝신 G 항체를 이용한 면역염색을 통해 확인하였다. 또한, 38번 계대 배양하여 노화시킨 섬유아세포에서 카텝신 G 활성을 조사하였다. Fn-f70 (0.5 µM) 또는 UVB (30 mJ/cm2)를 섬유아세포에 처리한 후 시간변화 (6, 12, 24 시간)에 따른 15,000개의 유전자 발현을 분석할 수 있는 cDNA microarray를 수행하여 유전자 발현양상에 대한 상관분석(Pearson correlation coefficients)을 실시하였다. cDNA microarray에서 관찰된 유전자들의 일부는 RT-PCR (real-time polymerase chain reaction) 방법을 사용하여 발현 변화를 재확인하였다. 5 종류의 serine protease 저해제들로부터 카텝신 G와 엘라스타제(elastase)에 대한 활성 저해능 및 active MMP-1 전환 억제능을 비교하여 specific하고 강력한 카텝신 G 저해제를 선별하였다. 카텝신 G 저해제에 의한 ECM 손상 억제평가는 3D dermal equivalents (3D DE) model에서 ECM 주요 마커들인 콜라겐, MMP-1, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1)의 유전자 및 단백질 변화를 quantitative real-time PCR (qRT-PCR)과 enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)를 사용하여 확인하였다. 카텝신 G 저해제의 항주름 효과를 알아보기 위해, UVB를 조사한 무모생쥐의 주름생성 변화는 모사판 분석(replica image analysis), 콜라겐의 양적 변화는 조직 생검 후 Masson trichrom 염색을 통해 확인하였다. 최종적으로 피부주름 감소의 원인과 관련된 Fn fragmentation 억제능과 MMP-2,9의 활성 저해능은 각각 웨스턴 블러팅(western blotting)과 자이머그래피(zymography) 방법을 사용하여 대조군과 비교 평가하였다. UVB 조사시 카텝신 G는 진피층에서 염색되었고, 특히 UVB 조사 후 48 시간에서 최대로 증가되었다. 또한 젊은 세포(passage 8)와 비교하여 노화된 세포(passage 38)는 카텝신 G 활성이 약 5배 증가되었다. 이러한 결과는 노화된 또는 자외선을 받은 피부에서 카텝신 G의 발현 및 활성이 증가 될 수 있음을 의미한다. Fn-f70와 UVB 처리 후 유전자 발현이 2배 이상 변화가 있는 149개의 유전자들 중 증가된 55개와 감소된 40개의 유전자들의 발현양상에 대해 상관분석을 실시한 결과 67.2%가 유사함을 알 수 있었다. DNA microarray를 통해 관찰된 유전자의 발현변화는 일부 유전자를 선택해 RT-PCR에서 확인한 결과 TPK를 제외한 유전자들이 유사하게 발현된다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 Fn-f70의 경우 자외선과 같이 MMP-1,2의 활성을 촉진해 ECM 손상을 유발하는 내인성 노화 인자로 작용할 수 있음을 예상할 수 있다. 5종의 serine protease 저해제들(β-ketophosphonic acid:KPA, 3,4-dichloroisocoumarin:DIC, chymostatin, N-acetyl-eglin C 그리고 Z-Gly-Leu-Phe-chloromethyl ketone)에서 KPA의 경우 카텝신 G에 대한 IC50 값은 30 nM, 엘라스타제에 대한 IC50 값은 20 µM로 측정되어 KPA는 엘라스타제보다 카텝신 G에 대해 강력한 저해효과가 있는 것을 확인하였다. 또한, KPA는 카텝신 G에 의한 Fn 분해 및 proMMP-1의 active MMP-1 전환을 농도의존적으로 억제시켰고, ECM 손상억제 평가를 위한 3D DE 실험에서도 카텝신 G에 의해 매개된 MMP-1 증가와 TIMP-1의 감소를 막고, 콜라겐의 발현을 증가시키는 효과가 있었다. 최종적으로 13 주 동안 UVB를 조사한 무모생쥐의 등에 0.025% KPA 도포시 대조군에 비해 콜라겐의 발현은 증가되었고, Fn 분해산물은 억제 되었으며 MMP-2,9의 활성을 감소시켜 자외선에 의한 주름생성 억제 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, Fn-f70에 의해 증가되거나 감소된 유전자의 발현양상이 UVB와 유사하다는 것을 통해 Fn-f70은 MMP 발현과 관련된 내인성 피부노화 유발에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 또한, KPA는 카텝신 G에 의해서 매개되는 Fn 분해를 막아 ECM 손상억제 및 MMP 증가를 감소시킴으로써 광노화 방지에 유용하게 사용 될 수 있다.
more초록/요약
Fibronectin (Fn) is an adhesion protein involved in various biological activities that include cell attachment, cell migration and wounding healing by mediating the binding of fibroblasts to collagen. It was previously reported that Fn is readily degraded by cathepsin G into four or five Fn-fragments (Fn-frs), and that cathepsin G expression is higher in the aged human skin compared with young skin and increases matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) expression through Fn fragmentation, and promotes the conversion of proMMP-1 to active MMP-1 in normal human fibroblasts (NHFs). Therefore, it was suggested that cathepsin G and Fn fragments contribute to matrix damage in aged skin. However, the profile of skin aging related genes by Fn-frs and the cosmetic utility of a cathepsin G inhibitor as anti-ageing agent have never been addressed. The major objective of this study was to investigate gene profiling by Fn-frs and UVB (30 mJ/cm2) and the utility of cathepsin G inhibitors on the cathepsin G-mediated ECM damages and UV-induced photoaging. The expression of cathepsin G from UVB (2 MED: minimal erythma dose) irradiated five young buttock skin samples (men, mean age, 33.5y) was conducted using by immunohistochemical staining using an anti-cathepsin G antibody. In addition, the effect of senescence on the activity of the cathepsin G released by NHFs at the 38th passage was also investigated. To compare the gene expression profiles in NHFs after treatment with Fn-f70 kDa or UVB (30 mJ/cm2), cDNA microarray analyses were performed assessing the expression levels of about 15,000 transcripts. The cells were examined 6, 12, and 24 hours after either treatment. It was confirmed that the changes of gene expression were observed by the DNA microarray analysis by RT-PCR analysis of a small set of these genes. It was also examined whether cathepsin G inhibitors have any effects on the cathepsin G-mediated ECM damages and UV-induced photoaging. Firstly, to choose a selective and specific cathepsin G inhibitor, 5 known serine protease inhibitors were examined for their inhibitory potency and selectivity against serine proteases such as cathepsin G and elastase. Secondly, to investigate the ECM protective effects of cathepsin G inhibitor (KPA), an in vitro 3D dermal equivalent (DE) model containing collagen, fibroblasts and Fn was constructed. In cathepsin G treated 3D DE model, the changes of the major ECM markers such as collagen, MMP-1 and TIMP-1 were measured from the cells and the conditioned medium using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Finally, an intensive study was carrier out to examine the potential ECM-protective effects of a cathepsin G inhibitor, β-ketophosphonic acid (KPA), in an in vivo UVB-irradiated hairless mouse skin model. Cathepsin G was expressed in the dermis of UVB irradiated skin and was strongly increased at 48 h after UVB treatment. Relative to young NHFs (passage 8), the replicatively senescent NHFs showed a five-fold increase in cathepsin G activity. These observations together support the notion that in aging or upon UV irradiation, cathepsin G expression or activity is upregulated in the skin. Fn-f70 and/or UVB treatment changed the transcript levels of 149 genes by >2-fold at one or more time points. Of the 149 transcripts, 55 and 40 were increased and decreased, respectively, by both Fn-f70 and UVB. Pearson correlation coefficients (r) indicated that Fn-f70 and UVB treatments had a similar effect with regard to the expression pattern of the 149 genes, as 95 of the 149 genes (67.2%) showed highly similar expression patterns (r≤-0.7 or r≥ 0.7) in Fn-f70- and UVB-treated cells. It was confirmed the changes of gene expression were observed by the DNA microarray analysis by RT-PCR analysis of a small set of these genes. The gene expression profiles revealed by the microarray and RT-PCR analyses were very similar, but the only discrepancy observed relates to TPK1. Thus, Fn-f70 may participate in the ECM damage induced by intrinsic aging and photoaging in skin by stimulating MMP-1 and -2 activity. It was also demonstrated that -ketophosphonic acid (KPA) showed the strongest potency and selectivity against cathepsin G. KPA could inhibit cathepsin G-mediated MMP-1 increase and alleviate the down-regulation of collagen and TIMP-1 gene expression in an in vitro 3D dermal equivalent (DE) model. Most importantly, the topical application of KPA (0.025%) to the dorsal skin of hairless mice enhanced collagen expression, and attenuated UVB-induced Fn fragmentation and up-regulation of MMP-2 and -9 activities, resulting in the prevention of UV-induced photoaging. These results indicate that the functions of Fn-f70-induced genes may important roles in skin aging like UVB, and cathepsin G inhibitors may be useful for the prevention of photoaging through the attenuation of cathepsin G-mediated ECM damages and MMP up-regulation.
more목차
국문요약 …………………………………………………………… 1
목차 ……………………………………………………………… 4
그림 목록 ………………………………………………………… 6
표 목록……………………………………………………………… 9
약어 ……………………………………………………………… 10
I.서론 ………………………………………………………………12
1.피부노화 ………………………………………… 12
2.항노화 연구 동향 ………………………………… 20
2-1 주요 이슈 …………………………………………………… 20
2-2 항노화 원료 개발 동향 ……………………………………22
2-3 기능성 항주름 원료 …………………………………………25
II.연구배경 …………………………………………………………27
1.피부 부착 단백질 …………………………………………… 28
2.피부노화와 Cell-ECM의 부착력 감소 …………………… 33
3.카텝신(cathepsin)의 피부 기능 …………………………… 36
4.연구목적 ……………………………………………………… 42
III. 실험 방법 …………………………………………………… 44
1.물질 …………………………………………………………… 44
2.실험 방법 …………………………………………………… 44
IV.실험 결과 …………………………………………………… 51
1. 항노화 타킷 단백질 발굴 ………………………………… 51
2. 카텝신 G 저해제의 항노화 효과 …………………………… 60
3. 천연물로부터 카텝신 G 저해제 탐색 …………………… 73
V.토의 …………………………………………………………… 76
VI.결론 ………………………………………………………… 81
VII.참고문헌 …………………………………………………… 83
영문요약 ……………………………………………………… 96
