H9N2 인플루엔자 바이러스 지놈을 특이적으로 인식하여 가수분해하는 항체 개발
Development of sequence-selective and nucleic-acid hydrolyzing antibodies targeting viral genome of H9N2 influenza virus
- 주제(키워드) 항체 , 인플루엔자 바이러스
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2011
- 학위수여년월 2011. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000011927
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
핵산 결합 항체는 DNA와 RNA에 염기서열과는 관계없이 무작위적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 3D8 VL (light chain variable single domain) 항체 역시 DNA/RNA와 결합하여 2가 금속이온의 존재 하에 가수분해하며, 살아있는 세포 내부로 스스로 침투하는 활성을 가진 항체이다. 최근 3D8 VL을 개량하여 핵산 가수분해능 및 세포 침투능은 유지한 상태에서 특정 유전자의 mRNA를 특이적으로 인식하여 가수분해하여 단백질 발현을 억제하는 기술을 개발하였고, 이러한 특정 유전자 침묵 (gene silencing) 가능한 항체를 세포 침투 간섭항체 (interfering transbody)라 명명하였다. 기존에 알려진 바이러스 단백질을 표적으로 하는 항-바이러스 중화항체의 경우, 바이러스 항원 변이에 따른 돌연변이가 일어나면 활성를 잃어버리고, 바이러스 지놈 또는 mRNA를 표적으로 하는 RNAi (RNA interference)의 경우 세포/조직 특이적 전달에 대한 한계점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 세포 침투 간섭항체 기술을 기반으로 인플루엔자 바이러스 H9N2 형의 nucleocapsid 단백질 (NP)을 코딩하는 유전자의 특정 염기서열에 특이적으로 결합하고 가수분해하여 바이러스 증식 억제를 유도할 수 있는 항체를 개발하였다. 3D8 VL 항체를 모체로 하여 라이브러리를 구축하였고, 효모세포 표면 발현 시스템을 이용하여 바이러스 NP 지놈 염기서열에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였다. 선별해낸 항체 asNP25를 정제하여 분석한 결과 비-타겟 기질보다 타겟 기질에 대한 결합력이 상대적으로 높고, 그에 따라 타겟 특이적인 가수분해능을 가지고 있었다. 또한 asNP25 항체 및 3D8 VL 항체를 바이러스 숙주세포인 A549 세포에 발현시킨 후 타겟 특이성을 확인해보았을 때, asNP25 항체는 타겟 염기서열에 대해서만 가수분해능을 보인 반면, 3D8 VL 항체는 타겟/비타겟 염기서열에 대해 모두 가수분해능을 보였고 숙주세포 내에서 세포 독성을 나타내었다. asNP25 항체 및 3D8 VL 항체를 바이러스 숙주세포인 A549 세포에 발현시킨 후 바이러스를 감염시킨 결과, 두 항체 모두 바이러스 NP 단백질 발현을 현저하게 감소시켰다. 본 실험 결과는 인플루엔자 바이러스의 지놈을 타겟으로 한 세포 침투 간섭항체가 바이러스 지놈을 직접적으로 가수분해하여 항-바이러스 효과를 나타내고, 숙주세포 내 독성을 감소시켜 치료제로 개발되었을 때의 부작용을 줄일 수 있음을 나타낸다.
more목차
I. 서론 1
1. 핵산 결합 항체와 세포 침투 간섭 항체 1
2. 인플루엔자 바이러스 A형 4
3. 연구의 목적 7
II. 실험 재료 및 방법 8
1. 시료 및 시약 8
2. 실험 방법 9
2.1 라이브러리 구축 9
2.2 Flow cytometry를 통한 선별 과정 9
2.3 단백질 발현과 정제 10
2.4 아가로즈 젤 전기영동을 통한 DNA 가수분해능 분석 11
2.5 타겟 기질 특이적 핵산 가수분해능 측정 11
2.6 3D8 VL variants의 핵산에 대한 정량적인 결합력 측정 12
2.7 세포 배양 12
2.8 3D8 VL 변이체 발현 세포주 확립 12
2.9 면역 형광 염색 14
2.10 세포 생존율 조사 14
2.11 3D8 VL 변이체 발현 세포주 내 기질 특이적 가수분해 정도 조사 14
2.12 3D8 VL 변이체 발현 세포주에서의 단백질 발현 조사 14
III. 결과 및 고찰 16
1. 3D8 경쇄 가변 부위 (light chagin variable single domain, VL) 변이체 설계 16
2. 타겟 기질 선정 18
3. 3D8 VL 라이브러리 구축 21
4. 인플루엔자 바이러스 NP 유전자에 대한 3D8 VL variants 선별 26
5. 3D8 VL variants 정제 29
6. 3D8 VL variants의 DNA 가수분해능 평가 29
7. 3D8 VL variants의 염기서열 특이적 가수분해능 평가 32
8. 3D8 VL variants의 염기서열 특이적 결합 평가 37
9. 3D8 VL variants의 세포 침투능 평가 40
10. 3D8 VL variants를 발현하는 A549 세포주 확립 42
11. asNP25의 세포 내 타겟 기질 특이적 가수분해능 조사 평가 45
12. 3D8 VL variants를 발현하는 A549 세포주의 H9N2 항-바이러스 효과 평가 48
IV. 결론 50
V. 참고문헌 52
Abstract 55
Appendix 56
