신경계 발달과정에서 JAKS의 발현 변화 및 그 역할
The Role of JAKS During Neurogenesis
초록/요약
뇌는 각각 분리되어 있는 뉴런들로 구성되어 있다. 이 뉴런(Neuron)들은, 구조적, 신진 대사적(metabolic), 그리고 기능적으로 독립적이다. 신경정보는 뉴런간의 시냅스(synapse)를 통해 전달된다. 또한, 뇌에 존재하는 또 다른 형태의 세포인 교세포(glialcell, gliaor neuroalia)는 뉴런의 활동을 보조한다. 신경전구세포(Neural progenitor cells, NPCs)는 성장인자를 공급받아 증식하거나, 뉴런 또는 교세포(Astrocyte, Oligodendrocyte등)의 뇌세포로 분화한다. 신경퇴행성 질환으로 고통받고 있는 환자들을 위해, 이런 신경전구세포를 이용해서 신경재생에 관한 많은 연구가 되고 있다. 이 신경전구세포를 배양해서 죽은 세포가 있던 부분에 이식한 후, 이 세포가 분열하여 신경세포로 분화하고 그 전에 하던 일을 하게 된다면 완전한 치료가 될 것이다. 따라서 신경전구세포의 생존과 분화를 조절하는 인자에 대한 이해가 필요하다. 이번 연구에서 배아 뇌에서 분리한 신경전구세포를 신경세포로 유도하는 기전에 대해 알아보았다. 먼저 뇌의 증식, 분화, 세포사하는 발달과정에 따라 대뇌에서의 Jaks 발현 변화를 관찰하였다. 마우스 배아뇌 11일부터 성인뇌가 되는 기간 동안 Jak3의 활성화 형태인 phospho form Jak3는 배아뇌 13일부터 증가하다가 생후 20일부터 감소되어 성체 뇌에서 확연히 발현이 감소한다. 반면, pJak2는 배아 15일부터 증가하여 성체 뇌에서 다량 발현한다. 신경전구세포 마커 중 하나인 Nestin과 pJak3의 발현을 배아 13일 뇌에서 비교해본 결과, 비슷한 부분에서 발현하고 있음을 면역염색을 통해 알 수 있다. Jaks이 뇌 발달 동안 신경전구세포에서 어떤 역할을 하는지 신경전구세포배양법을 이용하여 알아보았다. In vitro 배양한 분화하지 않은 신경전구세포(한 개세포 또는 sphere형태세포)는 pJAK3를 발현한다. JAK3 억제제 처리는 pJAK3 발현을 감소시키고 TUJ1과 MAP2를 발현하는 Neurite growth와 migration을 유도하였다. 날짜가 지남에 따른 형태적 변화를 분석해 보았다. 성장인자가 있는 조건에서 신경전구세포는 날짜가 지남에 따라 뉴런과 교세포로 점차 분화하였다. Jak3 억제제 처리는 전구세포의 비율은 줄이면서 뉴런과 oligodendrocye의 분화를 증가시키고, Astrocyte의 분화는 감소시켰다. mRNA level에서 Jak2 억제제와 달리 Jak3 억제제에 의해 Tuj1, Olig2, Ncam 발현이 증가되었고, protein level에서 뉴런의 마커인 MAP2, Tuj1와 oligodendrocyte marker인 NG2, O4 발현이 WHI-p154 1, 3 μM 농도에 따라 증가하였다. 억제제 또는 siRNA를 사용하여 JAK2와 JAK3를 각각 억제시켜 형태적변화, 유전자변화, 단백질 변화를 확인해보았을 때, JAK2억제는 전반적인 세포의 증식과 분화를 억제하는 양상을 띄었고, JAK3억제는 뉴런과 oligodendrocye의 분화를 증가시키면서 astrogenesis는 억제했다. JAK3 억제에 의해 일어나는 뉴로제네시스 현상은 성장인자 고갈로 인한 apoptotic 세포사의 과정에서도 나타났다. 신경전구세포는 bFGF나 EGF같은 성장인자가 없으면 세포사하게 되는데, JAK3 억제제에 의해 분화되어 생존하고 분열했다. 위의 현상을 일으킬수 있는 뉴런분화조절인자들 중에는 Hes가 있다. Hes1은 신경전구세포의 증식을 유도하면서 뉴론분화인자인 Ngn을 억제한다. 뉴런분화시기에는 Hes6가 발현하면서 Hes1을 억제하여 뉴론으로의 분화를 촉진한다. 본 실험에서 JAK3 억제제는 신경전구세포에서 Hes6의 발현을 증가시키고, Hes1의 발현을 감소시키고, Ngn2, NeuroD의 발현을 증가시킴을 확인했다. 이 결과로 신경전구세포의 진화과정에서 뉴로제네시스는 JAK에 의해 조절되고, 이로 인한 신경전구세포의 분화는 Hes, Ngn, NeuroD 조절 기전에 의해 MAP2, TUJ1 같은 뉴런마커를 유도함을 밝힘으로써, 신경전구세포에서 JAK3의 역할을 규명하였다.
more목차
Ⅰ. INTRODUCTION 1
A. Neurogenesis 1
B. Growth Factor 2
C. The Role of JAK3 3
D. Differentiation Regulator 3
E. Aimes of this Study 4
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 5
A. Materials 5
B. Cell cultures 5
1. Cortical primary neurosphere cultures 5
2. NPC enriched cell culture 6
C. Cell death analysis 6
1. TUNEL assay 6
2. Trypan Blue staining 6
D. Immunohistochmical stain 7
E. Gel electrophoresis and Western blotting 7
F. RNA preparation and RT-PCR 8
G. siRNA transfection and reagents 9
H. Statistical analysis 9
Ⅲ. RESULT 11
A. In vivo Expression of JAK3 in the Brain during Development 11
B. Effect of JAK3 Inhibition on Re-dissociated NPCs 13
C. Effect of Jak3 siRNA transfection 21
D. Effect of JAK3 Inhibitor on Neurospheres NPCs 24
E. Comparison of JAK3 and JAK2 inhibition with inhibitor 24
F. Effect of Jak2 and Jak3 siRNA transfection 29
G. Brain Cell marker expression change by JAKs inhibitor 30
H. Interplay with Intrinsic Regulators of Neurogenesis 34
I. Effect of JAK3 inhibitors on GF-depletion-induced NPC death 34
Ⅳ. DISCUSSION 39
Ⅴ. CONCLUSIONS 47
REFERENCES 48
국문요약 63
