인간 난소암세포게서의 세포 사멸 기전에 관한 연구
Understanding of apoptotic signaling mechanisms in human ovarian cancer cells
- 주제(키워드) apoptosis , 세포 사멸 기전 , 난소암
- 발행기관 The Graduate School, Ajou University
- 지도교수 Min, Churl-Ki
- 발행년도 2011
- 학위수여년월 2011. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000011389
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Paclitaxel (Taxol^(TM)) is extensively used clinically for chemotherapy of patients with ovarian, breast, and lung cancer. Although taxol induces apoptosis of cancer cells, its exact mechanism of action is not yet known. To gain insight into the mechanism of action of this drug in ovarian cancer, we tested the effects of taxol on the apoptototic pathways in human ovarian carcinoma cell line, SKOV3 cells. We observed that taxol induced apoptosis of these cells evidenced by phosphatidylserine (PS) externalization and DNA fragmentation. While treatment of cells with taxol resulted in bcl-2 phosphorylation and mitochondrial depolarization, cytochrome c was not released nor apparent activation of pro-caspase-3. Treatment of SKOV3 cells with taxol, however, resulted in the translocation of apoptosis inducing factor (AIF) from the mitochondria to the nucleus. Taken together, these findings suggest that, in SKOV3 cells, taxol induces caspase-independent, but AIF-dependent apoptosis. c-jun N-terminal kinase (JNK) represents a member of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) involved in many cellular responses including proliferation or survival after exposure to stress, but the majority of published evidence supports JNK’s role in conveying apoptotic signals when cells are exposed to DNA damage, or anticancer therapies. We examined the characteristics of JNK in apoptotic signaling cascade probed with paclitaxel in SKOV3 cells. We observed that paclitaxel induced apoptosis of SKOV3 cells by activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK), phosphorylation of JNK and bcl-2, bax translocation onto mitochondria, decreased mitochondrial membrane potential and AIF releasing. Treatment of cells with SP600125, inhibitor of pJNK, almost completely blocked the apoptotic death, demonstrating that JNK is key molecule in apoptotic signal cascade induced by anti-cancer drug, taxol. when wild-type p53 is restored in SKOV3 cells, SKOV3 cells exhibited the emergence of cleaved forms of PARP and active forms of caspase-3 and 7 in response to taxol treatment. Furthermore, activation of caspase-3 and 7 were blocked by SP600125 treatment, in SKOV3 cells, regardless of p53 presence. Next, we examined the ability of the synthetic selenium compound, 2-(4-methylphenyl)-1,3-selenazol-4-one (hereinafter designated 3a), to induce apoptosis in SKOV3 cells and a human leukemia cell line, HL-60. Flow cytometry showed that 3a treatment induced apoptosis in both cell lines to degrees comparable to that of the positive control, paclitaxel. Apoptosis was measured by PS externalization, DNA fragmentation and decreased mitochondrial membrane potential (MMP). However, analysis of the mechanism of action revealed differences between the responses of the two cell lines. Treatment with 3a arrested the cell cycle and induced caspase-3 activation in HL-60 cells, but not in SKOV3 cells. In contrast, 3a treatment induced apoptosis through translocation of AIF, a novel pro-apoptotic protein, in SKOV3 cells, but not in HL-60 cells. Collectively, our data demonstrated that 3a induced apoptosis in both cell lines, but via different action mechanisms.
more초록/요약
Paclitaxel (Taxol^(TM))은 난소암, 유방암, 자궁암, 폐암 환자들의 임상적 치료를 위하여 광범위하게 사용하는 약물이다. 비록 Taxol이 결과적으로 암세포를 사멸 시키는 효능을 가지는 강력한 항암제이기는 하지만, Taxol에 의한 암세포 사멸과 관련한 세포 내부의 신호 전달 과정에 대해서 정확하게 규명되지 않았다. 이러한 항암 효과를 가지는 약물에 대한 세포 내부의 신호 전달 기전을 확인하기 위해,난소 표피 암세포에서 유래한 SKOV3 세포주에 Taxol을 처리하였다. Taxol에 의해 세포 사멸이 유도된 SKOV3 세포주에서 phosphatidylserin (PS)의 externalization과 DNA의 절편화, Bcl-2 단백질의 인산화, 그리고 미토콘드리아 탈분극화 현상이 관찰되었다. 반면에 다른 세포주에서, 동일한 항암제 처리 후 관찰되었다고 보고된 cytochrome c의 세포질로의 유리화나 caspase-3 같은 단백질 분해 효소의 활성화 등은 관찰되지 않았다. 그러나 세포 사멸 유도 인자 (AIF)는 미토콘드리아에서 유리되어 세포의 핵 내로 이동하는 현상을 확인하였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, Taxol을 처리한 SKOV3 세포주에서는 caspase 비의존적 세포 사멸 기전이 진행된다고 사료된다. c-Jun N-terminal 인산화 효소인 JNK는 세포 분화 활성화 단백질 인산화 효소의 일종으로, 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 내 신호 전달에 관여한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 Taxol에 의해 유도된 세포 사멸에 관련한 세포 내 신호전달 기전 과정에서의 JNK의 역할과 기능을 확인하고자 하였다. Taxol의해 세포사멸이 유도된 SKOV3 세포주에서 인산화를 통한 ASK1의 활성화, JNK와 Bcl-2의인산화, Bax의 세포질에서 미토콘드리아로의 이동, 미토콘드리아의 탈분극화 및AIF의 유리화를 관찰하였다. 또한 JNK 기능 억제제인 SP600125를 사용하였을 때,taxol에 의한 세포 사멸 정도가 감소함도 확인하였다. 위의 모든 실험 결과를 종합해 볼 때, 암세포의 항암제에 의한 세포 사멸 기전은 JNK를 통한 강력한 암억제 인자인 p53을 활성화와 이로 인한 caspase 의존적 세포 사멸 기전이 유도 되며, 또한 p53의 돌연변이 또는 기능 억제로 인해 발생한 암세포인 경우, JNK를통한 caspase 비의존적 세포 사멸이 진행됨을 확인하였다. 2-(4-methylphenyl)-1,3-selenazol-4-one (이후 3a라 축약, 셀레늄이 포함된 새로운합성 항암 물질)의 역가와 세포 내 신호전달 기전을 확인하고자, 인간 난소 표피암의 일종인 SKOV3 세포주와 인간 혈액암의 한 종류인 HL-60 세포주에 3a를 처리하였다. 유세포 분석을 통하여 두 세포주에서, taxol을 처리한 두 세포주와 비교해 볼 때, 수치상 보다 높은 암세포 사멸 효능을 나타내었다. 3a를 처리한 두 세포주에서 세포 사멸 과정 시 나타나는 phosphatidylserin (PS)의 externalization과 DNA의 절편화를 관찰 할 수 있었으나, 사멸에 이르는 세포 내 신호 전달 과정을 다르다는 결과물을 확인하였다. SKOV3 세포주와는 달리 HL-60 세포주에서는 세포 주기가 지연되는 현상과 caspase-3의 활성화를 나타내었다. 반면에 SKOV3에서 보이는 세포 사멸 유도 인자 (AIF)의 세포질 내로의 유리 및 핵으로의 이동을 확인한 반면, HL-60 세포주에서는 AIF의 이동이 관찰되지 않았다. 결과적으로 3a 의 항암 효과는 두 세포주에서 서로 다른 세포 사멸 신호 전달 기전을 통해 진행됨을 확인 하였다.
more목차
Chapter1 : Mechanism of taxol-induced apoptosis in human SKOV3 ovarian carcinoma cells
1.1 Introduction 6
1.2 Material and Methods 9
1.3 Results 14
1.3.1 Cell cycle arrest and DNA fragmentation 14
1.3.2 Taxol did not activated caspase-3 14
1.3.3 Taxol induces mitochondrial depolarization 15
1.3.4 ROS is not generated by taxol treatment 15
1.3.5 Effect of taxol on AIF translocation into nucleus 16
1.4 Discussion 17
1.5 References 20
1.6 Figure regends 27
Chapter2 : 2-(4-methylphenyl)-1,3-selenazol-4-one induces apoptosis by different mechanisms in SKOV3 and HL60
2.1. Introduction 36
2.2. Material and methods 38
2.3. Result
2.3.1. Cytotoxcity 43
2.3.2. DNA fragmentation 43
2.3.3. 3a induces caspase-3 activation in HL 60 but not SKOV3 cells 44
2.3.4. 3a induces mitochondrial depolarization 44
2.3.5. AIF translocates into the nucleus in response to 3a treatment in SKOV3 but not HL 60cells 45
2.4. Discussion 47
2.5. References 50
2.6. Figure regends 56
Chaper3: Roles of JNK and p53 in taxol-induced apoptotic signaling in SKOV3 human ovarian cancer cells
3.1. Introduction 64
3.2. Material and methods 67
3.3. Results
3.3.1. Activation of JNK by taxol 72
3.3.2. Sp600125 suppresses apoptotic cell death in SKOV3 73
3.3.3. Bcl-2 is phosphorylated and its translocation to mitochondria is accelerated by taxol 74
3.3.4. SP600125 attenuates the taxol-induced mitochondrial depolarization and AIF release from the mitochondria 76
3.3.5. Caspase-dependent apoptosis by taxol treatment when p53 is present in SKOV3 cells 77
3.4. Discussion 79
3.5. References 84
3.6. Figure regends 94
Chapter4 : Conclusion
4.1 Conclusion 104
4.2 References 110
