에스터라아제의 구조적 그리고 기능적 연구
Structural and Functional Studies of esterases
- 주제(키워드) esterase , (R/S)-ketoprofen ethyl ester , protein three demansional structure , enantioselectivity , site directed mutagenesis
- 발행기관 The Graduate School, Ajou University
- 지도교수 Ryu,Yeon-Woo
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000011013
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Widespread application of enzymes of discriminating optical isomers depends on the stability for temperature and solvent as well as high resolution of the stereoisomers. In order to separate optical isomers, we have examined the enantioselectivity toward to (R,S)-ketoprofen ethyl ester of various esterases and carried out gene cloning and purification of those for a long time. As a result, we isolated three esterases based on enantioselectivity; (R)-specific esterase (Esterase JY144), (S)-specific esterase (Esterase 1767) and none-specific esterase (EST 25) and also two esterases partially enantio-selectivity on (R,S)-ketoprofen ethyl ester, which are (S)-preferential esterase (Est-Y 29) and (R)-preferential esterase (Est-AF). In order to reveal that what makes these enzymes have different enantioselectivity, it is necessity to understand interaction or dynamics between protein, especially enzyme active site and substrate binding site, and substrate during the enzyme reaction. In order to find condition for improve enantioselectivity of esterase various organic solvent was applied during enzyme reaction and methanol and ethanol was most affective to increase enantioselectivity. To solve three dimensional structures of these esterases will give us the information that help understanding enzyme’s catalytic mechanism and substrate specificities for (R/S)-ketoprofen at the molecular level. First step for solving three dimensional structures of protein is getting fine quality protein crystal for X-diffraction. Through the esterase crystal obtainment trial, only two esterase, none-specific esterase(Est 25), (S)-preferential esterase (Est-Y 29), are succeed and solved the three dimensional structures of these two protein through X-ray diffraction. Also, I got the information of interaction data of substrate and enzyme by co-crystallization substrate and enzyme, which lost activity by substituted catalytic amino acid (serine) into alanine. And, based on the results, I searched the amino acid resides that cause increase of enantioselectivity by substituted in to another amino acid, and carried out site-directed mutagenesis of enzymes and checked the enzymatic characters, most importantly enantioselectivity. As the result, several mutant esterases were obtained which showed enhanced enantioselectivity. Among the five esterases, only two esterases could be analyzed structurally. Because it takes time and effort sometimes luck, to grow protein crystal. It was necessity to find another esterase which have similar enantioselectivity to applied crystal try out. So I used database for bioinformatics to search esterases expected to have similar enantioselectivity based on similar amino acid sequence and structure of esterases which are still in the process of crystallization. Only one esterase from Caulobacter crescentus CB15, named Est CC, could hydrolyze the rac-ketoprofen ethyl ester and has high homologue identity (38%) with (S)-specific esterase (esterase 1767). However, Est CC showed similar hydrolysis activity toward to rac-ketoprofen ethyl ester. Est CC was also applied to crystal tryout. In further study, if the 3D structure of esterase 1767 and Est CC were solved it would helpful to demonstrate the relationship between protein structure and optical specificity, then through this work, effective and improved enzymes for certain purpose will be acquired easily.
more초록/요약
광학이정질체 분리에 사용되기 위한 효소들은 높은 열안정성과 유기용에 대한 내성 뿐만 아니라 높은 입체이성질체 분리능력을 가지고 있어야 한다. (R,S)-ketoprofen ethyl ester에 대한 높은 광학선택성을 가진 효소를 찾고자 다년간 연구한 결과 (R)- ketoprofen ethyl ester 대한 높은 광학 선택성을 가지는 에스터라아제 JY144 와 (S)-ketoprofen ethyl ester에 높은 광학선택성을 가지는 에스터라아제 1767 과 광학선택성을 가지고 있지 않은 에스터라아제 EST 25, 그리고 (S)-ketoprofen ethyl ester에 대하여 좀더 높은 광학선택서을 보이는 에스터라아제 Est-Y 29 와 (R)-ketoprofen ethyl ester 좀더 높은 광학선택성을 가지는 에서터라아제 Est-AF 등 다섯 종류의 에스터라아제를 분리하였다. 효소반응 중에 효소의 광학 선택성을 증가 시기기 위한 조건을 찾기 위해 에탄올등을 포함한 유기용매를 첨가하여 실험을 한결과 에탄올 또는 메탄올이 첨가 되었을 경우에 EST 25의 광학선택성이 증가 하엿다. 어떤 이유로 각각의 에서터라아제가 각기 다른 광학선택성을 가지는지 밝혀내기 위하여 기질과 효소의 활성 부위 및 기질 결합 부위 간의 상호작용을 이해하는 것이 중요하다. 이를 이해하기 위해서는 효소의 3차 구조를 밝혀내는 것이 가장 시급한 일다. 단백질의 3차 구조를 풀기 위해서는 제일 먼저 단백질 결정을 얻는 것이 처음 단계인데, 이들 5종의 효소들 중에 EST 25 와 Est-Y 29의 단백질만을 얻을 수 있었다. 이렇게 얻는 단백질 결정으로 X-선 회절 분석을 이용하여 이 두 단백질의 3차 구조를 풀 수 있었으며, 효소 촉매 작용에 관여하는 세린을 알라닌으로 바꿔 효소 활성을 없앤 돌연변이 효소와 기질을 함께 결정화 하여 기질이 결합 하고 있는 효소의 3차 구조 역시 풀 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 효소의 광학선택성 증가에 도움을 줄 수 있을 것으로 보이는 을 아미노산 잔기들을 선택하고 이들 선택된 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 site directed mutagenesis 방법으로 점 돌연변이를 유도하여 각각의 특징을 분석한 결과 광학선택성이 변한 돌연변이 효소를 획득 할 수 있었다. 이 두 효소의 3차 구조 정보 이외에 다른 광학선택성을 가지는 효소의 3차 구조를 밝히면 위의 두 3차 구조 정보와 함께 단백질의 광학선택성에 관한 정보를 찾는데 많은 도움이 될 것으로 기대가 된다. 다른 효소들의 아직 결정을 획득 하지 못하였다. 단백질 경정을 얻지 못한 단백질 중 (S)-ketoprofen ethyl ester에 높은 광학선택성을 가지는 에스터라아제 1767 와 비슷한 광학선택성을 가지는 효소를 찾기위하여 1767의 아미노산 서열 정보를 가지고 생물정보학 데이터 베이스를 이용 새로운 효소들을 찾았다. 새로이 찾은 이 효소는 Caulobacter crescentus CB15로부터 유래했으며, 1767 과는 38 % 의 상동성을 보인다. 이 새로운 에스터라아제는 ketoprofen ethyl ester 대한 광학 선택성 없었다. 그러나 기질의 농도가 높을 경우에는 광학선택성이 감소하였다. 이 효소의 3차 구조를 얻기 위하여 단백질 결정화 실험을 진행하고 있으며, 이 에스터라아제와 1767의 3차 구조를 밝혀 Est 25와 비교를 하면 효소의 구조와 광학선택성간의 상관관계를 밝히는 많은 도움이 될 것으로 기대된다.
more목차
I. General Introduction 1
1. Esterases as one of the most promising biocatalysts 1
2. Esterase structure and enzyme reaction mechanism 6
3. Chiral drugs and Ketoprofen 11
4. Aims of this study 16
II. Reaction condition optimizing for increasing the enantioselectivity of esterases 20
1. Introduction 20
2. Experimental Procedures 22
3. Result and discussion 23
4. Summary 27
III. Three dimensional structures of two esterases: Est 25 and Est-Y 29 28
1. Introduction 28
2. Experimental Procedures 31
2.1. Protein expression and purification 31
2.2. Crystallization 32
2.3. X-ray data collection and processing 33
3. Result and discussion 34
4. Summary 43
IV. Improvement of enzymatic characteristics of esterases 45
1. Introduction 45
2. Experimental Procedures 50
2.1. Site-directed mutagenesis 50
2.2. Searching for the possible candidate amino acid sequence to enhance enantioselectivity 53
2.3. Measurement of esterase activity with ketoprofen ethyl ester 58
3. Result and discussion 59
3.1. Substrates and esterase binding mechanism 59
3.2. Mutation and characterization of mutant enzymes of Est 25 64
3.3. Mutation and characterization of mutant enzymes of Est-Y29 74
4. Summary 79
V. Searching and cloning for novel esterase using esterase sequence data 82
1. Introduction 82
2. Experimental Procedures 85
2.1. Search for high homologue identified esterase and sequence alignment 85
2.2. Cloning, protein expression and purification 85
2.3. Measurement of esterase activity with ρ-Nitrophenyl derivatives 86
2.4. Measurement of esterase activity with ketoprofen ethyl esters 86
2.5. Enzyme kinetics assays and enantioselectivity 88
3. Result and discussion 89
3.1. Esterase cloning, purification and amino acid analysis 89
3.2. Measurement of esterase activity with ρ-Nitrophenyl derivatives 95
3.3. Esterase activity with ketoprofen ethyl ester, enzyme kinetic assay and enantioselectivity 97
4. Summary 101
VI. Conclusion and Further Study 103
VII. References 105
VIII. Abstract in Korean 111
