한국인 혈우병 A 환자에서 원인 유전자의 유전자형 분석 및 억제적 항체 발생에 관한 연구
The profiling of coagulation factor VIII genotype and the mechanism of inhibitory antibody development in Korean hemophilia A
- 주제(키워드) 혈우병
- 발행기관 The Graduate School, Ajou University
- 지도교수 Kim,Hye- Sun
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 파일정보 PDF
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000011010
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
이론적 배경 혈우병 A은 X-염색체에 연관된 출혈성 질환으로, 발병율은 5000명 남아 중 1명에게서 나타난다. 혈우병 A의 원인은 8번 혈액 응고인자의 기능 상실이다. 8번 혈액응고인자의 유전자 (F8)은 약 180kb로 매우 크며, 26개의 엑손으로 구성되어 구조적으로 복잡하다. 다른 유전질환과 유사하게, 혈우병A에서도 다양한 돌연변이가 발견되는데 그 종류는 인트론 1, 인트론 22에서 나타나는 상동성 재조합 (역위), 점돌연변이, 결실, 그리고 삽입이다. HAMSTeRS에 현재까지 보고된 돌연변이의 종류는 약 900여 종 이상이다. 또한 혈우병 치료에 새로운 난점으로 나타난 것이 억제적 항체 발생이다. 이러한 항체 환자는 혈액응고인자 보충요법에 저항성을 보인다. 최근 F8유전자 형과 개별환자의 면역 시스템관련 유전자가 항체 발생의 결정적인 위험인자로 나타난다는 보고가 있다. 목적 F8 유전자형은 혈우병의 분자적 진단과 항체 발생의 위험인자의 예측에 있어서 중요하다. 하지만 한국 혈우병 환자의 유전자형 데이터 베이스가 부족하다. 그러므로 F8 유전자형의 조사가 필요하다. 또한, 많은 연구자들이 억제적 항체 발생과정을 설명하고 있다. 그럼에도 불구하고 항체 발생의 원인은 아직 잘 모르고 있다. 그러므로 본 연구자는 항체 환자와 비항체 환자사이의 차등 발현되는 유전자를 조사하고자 한다. 세번째 목적은 새로운 8인자 단백질 다형성 검출 기법의 개발에 관한 것이다. 많은 분자생물학적 진단기법에도 불구하고 좀더 직접적인 진단기법이 보인자 검사와 산전검사에 필요하다. 재료 및 방법 F8 돌연변이 검사를 위해 다음과 같은 4단계 조사 방법을 시행하였다; long distance-PCR (인트론 22 역위 조사), multiplex-PCR(인트론 1 역위 조사, 엑손 결손 조사), 직접염기 분석법(염기서열 변이 조사). F8 유전자형 조사의 대상은 38명의 한국인 혈우병 A환자를 대상으로 하였다. 또한, 항체 환자와 비항체 환자 사이의 차등발현 유전자를 조사하였다. 차등발현 유전자의 조사를 위해 전체 유전체 발현을 2명의 비항체 환자와 5명의 항체 환자를 대상으로 하여 미세배열 방법을 사용하였다. 차등발현된 유전자의 검증을 위해 반정량적 RT-PCR법을 이용하여 CXCL5, PTGS1, C1QB1, CCL3L3, PPBP, 그리고 IL8 유전자의 발현을 조사하였다. 새로운 8인자 단백질 다형성 검출법 개발을 위해, F8 유전자를 pGEX4T-2 운반체에 클로닝하였다. 클로닝된 F8 유전자는 과발현시키고 정제한 후 도메인 특이적 항체 생산의 항원으로 사용할 것이다. 결과 이번 연구에서 38명에게서 33개의 돌연변이를 확인할 수 있었다. 이중 15명(39.5%)의 인트론 22역위, 1명(2.6%)의 인트론 1 역위, 1명(2.6%)의 대결손, 5명(13.2%)의 결실, 2명(5.3%)의 삽입, 6명(15.8%)의 과오돌연변이, 그리고 3명(7.9%)의 무의미 돌연변이를 확인하였다. 5명의 환자에서는 돌연변이를 확인할 수 없었다. 또한 차등발현 유전자 조사 결과 항체 환자에서 384개의 유전자의 발현이 증가하였고, 161개의 유전자의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 총 545개의 차등발현 유전자를 PANTHER 분류법에 따라 분류하였다. 예상했던 것과 같이 신호전달과 면역관련 유전자의 발현 변화가 항체 환자에서 두드러지게 나타났다. 이러한 발견을 확인하기 위해 7개의 선별된 유전자를 반정량적 RT-PCR을 통해서 확인해보았다. 이중 C1QB1과 PTGS1유전자가 항체 환자에서 차등발현 되었고, CXCL5유전자는 크게 다르지 않았다. 다른 4개의 유전자의 발현은 미세배열결과와 유사하게 나타났다. 특히 PTGS1 유전자는 항체 환자에게서 두드러지게 발현변화가 나타났다. 결론 본 연구는 한국인 혈우병 환자에서 나타나는 F8의 유전자형을 조사하였다. 이 돌연변이 중 인트론 22의 역위가 가장 일반적인 형태였으며 이는 다른 연구와 같은 결과이다. 한국인 혈우병 A환자에서는 처음으로 인트론 1역위를 확인할 수 있었다. 또한, HAMSTeRS에 등록되지 않은 8명의 신규 돌연변이를 확인 할 수 있었다. 이번 연구에서 사용된 돌연변이 결과는 한국인 혈우병의 진단과 보인자 검사의 좋은 참고자료로 사용될 수 있을 것이다. 또한 전체 유전자 발현 조사 결과는 면역관련 유전자와 신호전달 관연 유전자의 발현 변화가 항체 환자에서 두드러지게 변화한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이러한 현상이 항체를 유발할 수 있는 인자인지 항체 발생에 따른 이차적인 현상인지 설명할 수 없었다. 그러므로 차등발현 유전자와 항체 발생의 민감성과의 상관관계를 밝히기 위해선 추가적인 연구가 필요하다.
more초록/요약
Background Hemophilia A (HA) is an X chromosome-linked inherited coagulation disorder with an incidence is one in 5000 men. It is caused by a malfunction of coagulation factor VIII(FVIII). The FVIII gene (F8) is extremely large (~180 kb) and structurally complex (26 exons). Similar to other genes involved in genetic disorders, F8 shows various mutations, such as homologous recombination at intron 1 and 22, point mutation, deletion, and insertion. There are currently 900 mutations listed in the HAMSTeRS(Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site) database. The major complication in the management of hemophilia is inhibitory antibody development, which renders factor replacement therapy ineffective. Inhibitors develop in about 20%–30% of the patients with severe HA. Recently, the F8 genotype or genes involved in individual immune systems have been shown to contribute to decisive risk factors for inhibitor development. Purpose The F8 genotype is important for the molecular diagnosis of hemophilia and prediction of risk factors for inhibitor development. However, the Korean HAgenotype database is not sufficient to understand this correlation. Thus, F8 genotypic profiling is necessary. Further, although many researchers have explained the inhibitor development process, the cause of inhibitor development is still unknown; this could be elucidated by investigating differentially expressed genes (DEGs) in patients with and without inhibitors. Moreover, despite the many molecular diagnosis methods available, a method for direct diagnosis of carriers or prenatal testing is needed. Therefore, the third purpose of this study was to develop a new detection method for FVIII polymorphism. Material and methods For detecting F8 mutations, four-step profiling protocol was used to 38 unrelated Korean patients with HA: long distance-PCR for intron 22 inversion, multiplex-PCR for intron 1 inversion and exonal deletion, and direct sequence analysis for sequence variation. I also performed global expression profiling for DEGs in two patients without inhibitors and five patients with inhibitors using a microarray technique. For validating the DEGs, semi-quantitative RT-PCR was conducted to CXCL5, PTGS1, C1QB1, CCL3L3, PPBP, CCLCL1, and IL8 genes. Real-time PCR was performed to the IL4, IL8, TNFα, CTLA4, and IFNγ which are related to the antigen-presenting pathway. To develop a new method for detecting FVIII polymorphism, F8 gene clone to pGEX4T-2 vector for F8 overexpression and affinity chromatography. Purified FVIII protein was applied for domain-specific antibody production.. Results In this study, 33 F8 mutations were identified: 15 inversions at intron 22 (39.5%), one inversion at intron 1 (2.6%), one gross exonal deletion (2.6%), five deletions (13.2%), two insertions (5.3%), six missense mutations (15.8%), and three nonsense mutations (7.9%). The mutations in five patients (13.2%) were unidentified. The whole-genome expression profiling showed that 384 and 161 genes were up-regulated and downregulated, respectively, in the patients with inhibitors compared with those without inhibitors. All the 545 DEGs were classifiable according to the PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships) Classification System. As expected, the expression levels of signal transduction- or immunity-related gene groups were significantly changed in the patients with inhibitors. In the semi-quantitative RT-PCR analysis to confirm these findings, the C1QB1 and PTGS1 genes were differentially expressed in the patients with inhibitors, while the CXCL5 gene showed no significant difference. The expression pattern of the four remaining genes was similar to the microarray results. Especially, the PTGS1 gene was significantly changed in the patients with inhibitors. Real-time PCR analysis showed that the IFNγ gene was upregulated but the TNFα and IL10 genes were down-regulated in these patients. Conclusion Among the F8 mutations in the 38 patients, intron 22 inversion was the most common defect, and is consistent with the findings of other studies. Intron 1 inversion was found for the first time in a Korean patient with HA. Further, eight novel mutations not listed in the HAMSTeRS database were reported. The mutational data obtained in this study should prove useful as a reference for diagnosing HA and detecting carriers in the Korean population. The whole-genome expression profiling showed that the genes related to immunity and signal transduction were differentially expressed in the patients with inhibitors; however, it is not clear whether this phenomenon arises from the inhibitor-inducing factor or as a secondary effect of antibody production. In addition, some genes of the antigen-presenting process were differentially expressed in these patients; these differences may be related to inhibitor development. Further studies are needed to clarify the relationship of each DEG with the susceptibility for inhibitor development. Although the number of patients is too low to show clear statistical significance, this study has contributed toward a better understanding of hemophilia.
more목차
I Introduction 10
A Hemophilia A 10
B Coagulation pathway 11
C Characteristics of F8 gene 16
D Factor VIII protein function and structure 20
E Inhibitory antibody development 26
F Immune response genes and inhibitor development 26
G Acquired hemophilia 29
H Purpose 32
II Materials and Methods 33
A Patients 33
B F8 genotyping methods 33
1 DNA extraction 33
2 Long distance-PCR for intron inversion test 33
3 Gross exon deletion analysis by multiplex-PCR 34
4 F8 sequence variation test by direct sequencing 36
C Global gene profiling of HA with inhibitors 36
1 RNA purification and cDNA synthesis 36
2 Microarray and expression analysis 36
3 Semi-quantitative RT-PCR 37
4 Real-Time PCR 37
D FVIII polymorphism in plasma level 40
1 Materials 40
2 SDS-PAGE and immunoblot Analyses 40
E Recombinant FVIII purification 41
1 cDNA synthesis 41
2 F8 cloning 41
3 GST-fused FVIII overexpression 43
4 Immunoblotting for chimeric FVIII detection 43
III Results 44
A The F8 genotype 44
1 Intron 22 inversion 44
2 Intron 1 inversion 46
3 Gross exon deletion 47
4 Direct sequencing analysis of F8 sequence variation 49
5 Summary of F8 mutations in Korean HA 50
B Profiling of the differentially expressed genes in inhibitor HA 54
1 Differentially expressed genes in inhibitor HA 54
2 Functional grouping of DEGs 54
3 Expression patterns of signal transduction- and immunity- related genes 58
4 Validation of the DEGs 60
5 Expression analysis of antigen presenting process genes by RT-PCR 62
C Acquired hemophilia 67
1 Acquired hemophilia and F8 genotyping 67
D Analysis of FVIII polymorphism 69
1 FVIII protein polymorphism 69
2 F8 gene cloning 72
3 FVIII fusion protein overexpression 75
IV Discussion 78
A Genotype of F8 in Korean hemophilia A 78
B Profiling of the differentially expressed genes in inhibitor developed HA 83
V Reference 86
VI Abstract in Korean 95
