인간 세포사멸 수용체 4(DR4) 및 5 (DR5) 와 종양괴사인자 (TNFa)에 각각 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 변이체의 친화도 개량
Affinity maturation of Kringle domain variants specifically recognizing human death receptor 4 (DR4), DR5 or Tumor necrosis factor-a
- 주제(키워드) affinity maturation , Kringle domain
- 주제(KDC) alternative scaffold engineering
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010389
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
선행 연구에서 크링글 도메인의 라이브러리를 효모 표면에 구축 한 뒤 표적 분자 (Human death receptor 4(DR4) 와 DR5 그리고 human tumor necrosis factor-α (TNF-α))에 특이적으로 결합하는 변이체를 선별하였다. 최종적으로 생물학적인 활성을 가지고 있는 5개(KD413, KD415, KD506, KD548, KDT26)의 변이체를 선별 하였다. DR4에 특이적 결합을 하는 KD413, KD415 그리고 DR5에 특이적 결합을 하는 KD506, KD548은 다양한 암 세포 주에서 apoptotic 세포 사멸을 유도하는 agonists로 작용하며, TNF-α 에 대해 특이적으로 결합 반응을 하는 KDT26의 경우 TNF-α 에 결합 함으로써 TNF-α 에 의해 유도되는 세포 독성을 중화시키는 antagonist로써의 기능을 보였다. 하지만 선행 연구에서 최종 선별된 5개의 변이체 모두 대조군인 TRAIL과 infliximab과 비교하여 낮은 친화도를 가지고 있다(KD=~10-7M). 친화도 향상을 위한 추가적인 개량 실험이 필요하였으며, 본 연구에서는 이들의 친화도 향상을 위한 실험을 수행 하였다. 생물학적인 활성을 비교 하여 KD413, KD548, KDT26을 친화도를 향상 시킬 parent mutant로 선정 하였고, 친화도 향상을 위한 라이브러리 구축에 앞서 결합 루프 동정 실험을 수행하여 표적 분자와의 결합 반응에 가장 많은 기여를 하는 루프를 밝혀 내었다. 3가지 표적 분자에 대해 Loop5와 Loop6이 결합반응에 가장 큰 기여를 하고 있었으며, 이들 두 개의 Loop 부위에만 제한적으로 아미노산 돌연변이를 유발시켜 라이브러리를 구축 하였다. Parent mutant 인 KD413, KD548, KDT26의 아미노산 서열을 50%정도 유지하면서 돌연변이가 유도되게 하였으며, 효모 표면에 발현시켜 구축하였다. 구축된 라이브러리는 고속 선별 기술인 MACS와 FACS시스템을 이용하여 선별하였고 3가지의 라이브러리에서 친화도가 향상된 7개(KD41321, KD41330, KD54807, KD54832, KDT2624, KDT29, KDT2640)의 돌연변이체들을 선별하였다. ELISA 분석을 통해 정량적으로 KD값을 측정하여 parent mutant의 친화도와 비교 하였으며, 선별된 돌연변이체들은 parent mutant와 비교하여 친화도가 10배이상 향상 되었음을 확인하였다. 또한 ELISA 분석을 통하여 parent mutant가 가지고 있던 표적분자에 대한 특이성도 가지고 있음을 확인 하였다.
more목차
국문요약 ……………………………………………………………..………………………. i
List of Tables ………………………………………………………..………………….……ііі
List of Figures ………………………………………………………..………………...…....іv
I. 서론 ……………………………………………………………………….………….……...1
1. Alternative scaffold 개발 배경…..………………………………………………..……..1
2.인간 플라스미노겐 크링글 도메인 2 기반 단백질 골격...…….........................…..…3
3. 결합루프 동정 전략 및 라이브러리 구축 전략 …..………………………….……...6
4. 연구의 목적 ……………………………………………………………………………...9
II. 실험 재료 및 방법 ………………………….……………….…………………………10
1. 시료 및 시약 …………………………………….……………………………..……..…10
2. 실험 방법 ……………………………………...……………………………….……..…..11
2.1. 결합루프 동정 …………………………………..………………………………..….11
2.1.1 결합부위 동정을 위한 back-mutated Loop mutants 구축……....…………….11
2.1.2 Back-mutated Loop mutants와 parent mutants (KD413, KD548, KDT26)의 효모세포 표면 발현………………………….……………………………………12
2.1.3 Back-mutated KD Loop mutants와 parent mutants Flow cytometric 분석…..12
2.2 라이브러리 구축 ……………………………………………………..………..…….13
2.3. MACS와 FACS를 이용한 선별…....…………...………………………………..…14
2.4. P.pastoris 에서 선별된 개별 클론의 발현 및 정제 …….……………………..…15
2.5 Size exclusion chromatography를 이용한 단백질의 분자량 확인..………...…….16
2.6. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용한 결합 친화도 분석 …17
III. 결과 및 고찰 ……………………………………………………………..….….............18
1. 결합루프 동정을 위한 back-mutated KD Loop mutants 구축 …...…………………18
2. Back-mutated KD Loop mutants와 parent mutants Flow cytometric 분석 ………...22
3. 라이브러리 구축 및 선별 ………………………….……….…………….………...….24
4. 단일 클론 선별 및 분석 ……………….…………….………………………..............33
5. 단백질의 발현 및 정제 ..………………………………………….……….………..…37
6. SEC을 이용한 단백질의 분자량 측정 및 비교 …………………………………..…39
7. ELISA 를 이용한 결합 친화도 분석…………….…………………………...…......…41
8. 결합 특이성 분석……………………………….………………………………………..45
IV. 결론 ..……………………………………………………………………………………..47
V. 참고문헌 .………………………………………………………………….………...……50
Abstract ...……………………………………………………………...….…………....…….54
Appendix .………..…………………………………………………..………………..…..….56
