마우스 유래 핵산 가수분해 항체의 인간화 항체 구축 및 기질 특이성 부여를 위한 항체 개량
Humanization of mouse nucleic-acid hydrolyzing antibodies and engineering for the sequence-specific hydrolyzing activity
- 주제(키워드) antibody , humanization , seqeunce-specific
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010326
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
마우스 유래 항 핵산항체를 치료용 목적으로 사용하기 위해서는 몇 가지engineering하여 변형을 주어야 한다. 첫 번째, 마우스 유래 항체이기 때문에 인간의 항체가 쥐 항체를 항원으로 인식하여 면역반응이 일어나 마우스 항체는 제거되게 되는 Human Anti-Mouse Antibodies(HAMA)가 일어나므로, 인간화 방법을 통하여 치료용 목적으로 쓰일 수 있도록 변형시켜야 한다. 그 중 가장 흔히 사용되고 쉽게 개량할 수 있는 방법은 기존의 항체가 기능을 갖는 아미노산 부위인 complementary determining region(CDR)부위만을 남겨둔 채 뼈대로 작용하는 Framework region과 Fc region을 인간의 몸에서 유래한 germline amino acid로 바꾸어 주는 CDR-grafting 방법이다. 본 연구는 CDR-grafting 방법을 통하여 m3D8scFv의 CDR을 human framework region 중 가장 안정한 framework인 VH3-Vk3 type의 framework에 grafting하여 h3D8scFv로 개량하였다. m3D8scFv와 h3D8scFv를 E.coli supernatant상에서 proteinA tag을 이용하여 soluble fraction으로 정제한 후, SDS-PAGE와 HPLC를 이용한 SEC data를 통해 동일한 크기를 갖음을 확인하였고, 또한 달라진 framework에도 불구하고, CD-spectroscopy를 이용하여 2차 구조를 측정하였을 때 마우스항체와 인간화 항체의 2차구조가 그대로 유지되었다. h3D8scFv는 기존의 m3D8scFv 보다 안정한 framework으로 옮겨졌기 때문에 Gdn-HCl을 이용한 unfolded fraction 측정하여 안정성이 증가되었음을 확인하였다. 항체의 기능성은 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 이용하여 ssDNA-40mer와 dsDNA-40mer에 각각 binding 시켜 DNA binding affinity를 비교하였고, agarose gel hydrolyzing activity test, Quanti-iTTMPicogreen？瑛？ 이용하여 정량적인 DNA hydrolyzing activity를 비교를 통하여 h3D8scFv가 m3D8scFv가 보유한 기능을 그대로 보존함을 알 수 있었다. 마우스 유래 항 핵산항체를 치료용 목적으로 사용하기 위해서 해야 할 또 다른 engineering방법은 염기서열 특이성을 부여하는 것이다. 일반적으로 항 핵산항체는 특정기질에 대한 선택성 없이 모든 핵산에 대하여 동일한 결합력을 갖으므로, 인체 내 투여 시 세포 내 모든 핵산에 결합하여 가수분해 시키므로 치료용 목적으로 사용이 불가능하다. 그러므로, 특정 핵산에만 선택적으로 결합을 한 후 가수분해 하여 치료용 목적으로 사용할 수 있도록 변형을 주어야 한다. 본 연구에서는 효모세포 표면 발현 시스템을 사용하여 특정 핵산에 선택적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 3D8 VL 항체에 두가지 라이브러리를 구축하였다. 첫번째 라이브러리는 3D8 VL과 DNA의 결합체를 분석하여 DNA와 결합에 관여하는 부분인 β-sheet의 C,C’,F-strand에 라이브러리를 구축하였다. 두번째 라이브러리는 첫번째 라이브러리가 많은 부분에 라이브러리를 주었고, positive charge가 많이 들어갈 것으로 예상되어 발현시 solubility에 문제가 생길 것으로 예상하여 strand중에서도 core region등의 stability와 solubility에 영향을 줄 residue를 줄여 라이브러리를 구축하였다. 본 연구는 우선 첫번째 라이브러리로 진행하였다. 이후, 이로부터 특정한 염기서열에 높은 결합력은 보여주는 항체를 선별하였다. 우리는 구축한 라이브러리를 EBY100 yeast cell에 형질전환하여 Yeast surface display system을 사용하여 Npro/E2 기질에 대하여 상대적으로 결합력이 높은 clone을 찾아내었다. Yeast surface에 display된 VL library를 Npro/E2를 target기질로 선정하고, MACS 3차,FACS 5차까지 sorting한 결과 off-target과 비교하여 target기질에 더 결합력이 높은 clone을 얻을 수 있었다. E.coli inclusion body로 expression 된 단백질을 dialysis refolding 방법을 통하여 정제하였고, 정제한 단백질을 agarose gel hydrolyzing activity test를 통하여 가수분해능이 유지 되었음을 확인하였다. 또한 soluble 상에서도 target기질에 대하여 결합력이 높은 지 확인하기 위하여 ELISA를 통하여 확인한 결과 Npro #74, E2 #10 clone이 target기질에 대하여 좀 더 결합력이 높은 것을 확인하였다. 이를 통하여, subtle difference를 구별할 수 있도록 단백질을 개량 하는 것이 가능하다는 것을 규명하였다. Engineering에 사용한 DNA가 많은 종류를 사용하지는 않았지만 이 시스템이 실제로 작용 한다는 것을 보여주기에 충분하다고 생각된다.
more목차
국문요약................................................................................................................................................ⅰ
List of Tables.........................................................................................................................................ⅱ
List of Figures.......................................................................................................................................ⅲ
Ⅰ. 서론...................................................................................................................................................1
1. 핵산결합항체.................................................................................................................................1
2. 인간화 항체의 제조.....................................................................................................................3
3. Classical swine fever virus............................................................................................................7
4. 연구의 목적...................................................................................................................................8
Ⅱ. 실험재료 및 방법..........................................................................................................................9
1. 시료 및 시약.................................................................................................................................9
2. 실험방법........................................................................................................................................10
2.1 박테리아 발현벡터의 구축....................................................................................................10
2.1.1 박테리아 발현벡터에 h3D8 scFv 유전자 클로닝......................................................10
2.1.2 박테리아 발현벡터에 h3D8 VH 유전자 클로닝.......................................................11
2.1.3 박테리아 발현벡터에 h3D8 VL 유전자 클로닝........................................................12
2.2 m3D8 scFv 와 h3D8 scFv, h3D8 VH 및 h3D8 VL 단백질 발현 및 정제.......................13
2.3 GdnHCl농도에 따른 h3D8 scFv와 m3D8 scFv의 안정성 변화.........................................14
2.4 Agarose gel hydrolyzing activity test…………………………………………………………14
2.5 h3D8 scFv 및 h3D8 VH, h3D8 VL의 DNA에 대한 정량적인 결합력 측정.....................15
2.6 m3D8 scFv와 h3D8 scFv의 DNA에 대한 정량적인 가수분해력 측정………………….15
2.7 CSFV 기질에 특이적으로 결합하는 라이브러리 구축.......................................................16
2.8 FACS 분석.................................................................................................................................16
2.9 Sorting …………………………………………………………………………………………17
2.10 Refolding…………………………………………………………………………………....18
Ⅲ. 결과 및 고찰................................................................................................................19
1. m3D8의 crystal구조와 h3D8의 WAM modeling data 비교..................................................19
2. 정제된 단백질의 2차구조 비교……………………………………………………………….23
3. h3D8 scFv와 m3D8 scFv의 안정성 비교..................................................................................25
4. Agarose gel hydrolyzing activity test…………………………………………………………..27
5. h3D8 scFv 및 h3D8 VH, h3D8 VL의 DNA에 대한 정량적인 결합력 측정.......................29
6. m3D8 scFv와 h3D8 scFv의 DNA에 대한 정량적인 가수분해력 측정................................32
7. Library construction……………………………………………………………………………35
8. 3D8 VL Focused Library 에서의 돌연변이체 선별…………………………………………39
9. 원하는 기질(Npro/E2)에 높은 결합력을 보이는 돌연변이체 선별....................................43
10. 선별된 클론의 E.coli발현벡터로의 cloning및 발현, 정제....................................................46
11. single clone agarose gel hydrolysis activity test……………………………………………….48
12. single clone binding activity test by using ELISA…………………………………………….50
Ⅳ. 결론.................................................................................................................................................53
Ⅴ. 참고문헌……………….…………………………………………………………………………56
Abstrat………………………………………………………...……………………………………...59
Appendix……………………………………………………………………………………………...60
