새로운 4개의 항균성 hexapeptide의 동정과 생화학적 그리고 현미경적 분석법을 통한 항균효과의 특성 연구
Identification of Four Novel Antimicrobial Hexapeptides and Characterization of Their Bactericidal Activities by Using Biochemical and Microscopic Analysis.
- 주제(키워드) antimicrobial peptide , AMP , Synthetic , Antibiotics , plant disease , control
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 문은표, 김재호 교수님
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 파일정보 원본+ 겉표지와 속표지
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010199
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
펩타이드성 항생제들은 (AMPs) 기존의 여러 문제를 가진 항생물질을 대체할 수 있는 새로운 세대의 항생제로 각광을 받고 있다. Positional scanning of synthetic peptide combinational library (PS-SCL)라는 방법을 통해서 네 개의 항균성 펩타이드들이 선발 되었다 (KCM11: TWWRWW-NH2, KCM12: KWRWIW-NH2, KCM21: KWWWRW-NH2, and KRS22: WRWFIH-NH2). 이들이 미생물의 성장률에 미치는 영향을 식물 병원성 세균과 일부 인체 병원성 균류의 검정을 통해서 살펴 보았다. KCM11 과 KRS22는 균류에 항균성이 상대적으로 강했으며 KCM12와 KCM21은 세균 류에 상대적 항균성이 강하였다. 이들의 식물 병원세균에 대한 항균력은 최소저해농도 (MIC)와 최소살균농도 (MBC) 두 가지 방법으로 측정하였다. 주요 검정 세균으로 한국에서 비교적 심각한 세균 병을 일으키는 Pectobacterium spp., Xanthomonas spp., and Pseudomonas spp 등이 사용되었다. 위의 결과들을 종합하면 4개의 항균성 펩타이드들중 KCM21이 가장 강한 항균성과 살균력을 가지고 있는 것으로 사료된다. 다양한 십자화과 작물에 세균 무름병을 일으키는 병원균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 을 이용하여 병징의 발병억제 실험을 시행하였다. 처리방법에 따라 차이는 있지만 KCM21을 200 µM 정도를 처리하면 세균성 무름병균에 의한 병 진전을 완전하게 막을 수 있다는 사실이 관찰 되었다. 또한MTT 실험을 통하여 이들 항균성 펩타이드 들이 인체나 동물 세포에 세포독성을 가지고 있지 않다는 것을 검증하였다. 이는 이 물질들이 실제 식물뿐 아니라 동물이나 인체의 감염에도 사용될 수 있다는 가능성을 시사한다. 이들의 작용 기작을 알아 보기 위해서 이들의 항균성과 살균력에 대한 Kinetic 실험을 수행하였고 또한 이성질체 (D-enantiomer)나 FITC를 N-terminal 쪽에 붙인 유도체들의 항균성과 살균력도 같이 검정하였다. 흥미롭게도 KCM21의 D-이성질체는 KCM21과 동일한 항균성과 살균력을 나타내었고 FITC를 N-terminal에 붙인 중합체는 그 항균성은 약 50% 정도 줄어들었으며 살균력은 거의 사라졌다. 공초점현미경 (confocal laser scanning microscope (CLSM)) 과 형광현미경 (fluorescence microscope) 등을 이용하여 네 개의 항균성 펩타이드들이 세균세포막의 투과성을 변화시켜서 정상 막에서는 통과가 되지 않는 FITC가 세포 안으로 들어가는 것을 보였으며 또한 KCM21의 FITC 중합체를 이용하여 항균성 펩타이드 자체도 자발적으로 세포 안으로 들어감은 보였다. 이런 결과는 이들이 막의 변형을 초래하여 항균성을 나타내는 것이 뿐만 아니라 이들이 세포 안으로 들어 가서 그 안에서 여러 대사들을 억제할 가능성을 제시했다. 최소살균농도 (MBC) 실험을 통해 이가 양이온이나 일가 양이온들이 이들 네 항균성펩타이드의 항균 활성에 미치는 영향을 조사한바 Ca+2 나 Mg+2 등의 2가 양이온들이 항균력에 큰 영향이 있었다. 이들 양이온들은 Gram 양성균에서는 미미한 차이를 야기 하였지만 Gram 음성 세균에 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000) 있어서 이들 양이온의 처리는 KCM21과 KCM11 등에 의한 살균활성를 급격히 낮추었다. 세균의 세포외막이 항균성 펩타이드 처리에 (KCM11 과 KCM21) 따라 변형되는 것을 전자 현미경 (SEM and TEM) 을 통해 확인 하였다. 세포 외막은 처리구에 따라 일부가 떨어져 나가거나 부푼 모습을 보였으며 이런 변화는 살균농도 이하의 낮은 농도처리 (6.25 µM)에서도 확인이 되었다. 전자 현미경을 통한 여러 결과들은 다시 AFM (atomic force microscope)을 이용하여 확인 되었다. 처리구와 비 처리구 사이에 세포는 형태적으로 큰 변화를 보였으며 표면의 세포 조도 (roughness)에 있어서도 큰 차이를 보였다. KCM21을 처리 했을 때 세포외막의 조도는 크게 증가 하였고 Gram 양성균인 Clavibacter michiganensis supsp. michiganensis 의 경우 표면이 부풀어 올랐으며 Gram 음성균인 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000의 경우 표면에 커다란 흠집들이 생겼으며 세포 주위에 소포체들이 (microcells) 관찰 되었다. 이들 소포체들의 존재는 이 펩타이드들의 작용기작이 detergent-like action 에 따른 다는 것을 시사한다. 또한 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000에서 세포 표면의 조도 증가는 살균농도 이하의 낮은 농도처리 (6.25 µM)에서도 확인이 되었으며 이런 조도의 증가는 1mM 정도의 CaCl2 처리에 의해 줄어 들거나 사라짐을 관찰하였다. 항균성 펩타이드이 막의 안정성을 저해 한다는 것은 확인 되었으나 구체적인 target site를 알아 보기 위해 세가지 실험을 수행하였다. 1-N-pheylnaphthylanmin (NPN) 을 통해 세포 외막이나 LPS (lipopolysaccharide)가 변성되는 가를 측정하였고 내막의 변성을 보기 위해 β-galactosidase assay를 수행하셨으며 전체적인 세포막의 안정성은 항균성 펩타이드 처리 후 A260 에서 흡광도를 증가시키는 핵산이나 단백질 등 macromolecule 들의 분비를 측정하였다. KCM21 이나 KCM11등의 처리는 외막뿐 아니라 내막의 안정성을 저해하는 것이 확인 되었으며 전체적인 막의 안정성도 dose-dependent 하게 저해 됨을 보였다. 살균보다는 정균 작용이 강한 chitosan 과 비교하였을 때, KCM21 등이 가진 살균력은 세균의 원형질막의 파괴나 변형에 의해 일어난다는 것을 간접적으로 증명하였으며 특히 이들 원형질막의 변성은 역시 Ca+2 의 처리에 따라 영향을 받았다. 항균성을 목표로 선발된 4개의 펩타이드는 양전위를 띠우며 따라서 음가 이온을 띠는 DNA와는 이온 결합한다. 이번 실험을 통해 이들 펩타이드들을 DNA에 처리하고 전기영동 후 gel 상에서 ethidium bromide로 확인을 해보면 밴드가 shift되는 것을 확인 하였으며 이런 결과는 여러 다른 양전위를 띠는 항균성 펩타이드 관련 실험에서 보고 된 것과 유사하였다. 하지만 새로이 발견된 사실은, 선발된 네 개의 항균성 펩타이드들이 DNA를 전기영동 중에 retardation 시킬 뿐 아니라 실제 DNA를 degradation 시킨다는 것을 확인 하였다. 또한 양전위가 가장 높고 또한 일반 세균에 대해 일반적인 항균력이 가장 좋은 KCM21의 DNA degradation 활성이 가장 강했으며 상대적으로 약한 양전위와 항세균 효과를 가진 KRS22의 DNA degradation 활성이 비교적 약했다. 어떤 기작으로 DNA를 degradation 시키는 지는 더 많은 연구가 필요하지만 일단 이 결과들은 지금까지 알려진 효소기능을 가진 펩타이드 중 매우 작은 사이즈에 해당하며 최소한 가장 작은 기능성 nuclease 선발이라는 의미가 있다. 또한 이 결과는 항균성과 연관하여 볼 때, 이 이들 항균성 펩타이드의 살균기작이 단지 원형질막의 변성에 의하지 않고 이들이 원형질 안으로 들어가서 DNA나 RNA의 분해 혹은 다른 단백질 등의 macromolecule 들의 정상적인 대사를 저해해서 생길 수 있다는 가능성을 제시해 준다. 결론 적으로 이 실험은 차세대 항생제의 개발에 요구되는 새로운 기작의 펩타이드성 항생물질의 개발에 필요한 여러 가능성을 타진 했으며 이번 실험을 통해 선발된 펩타이드들은 실제 식물 병 방제에 사용 될 가능성이 있다는 것을 보여 주었다.
more목차
Table of Contents
Abstract (Korean) i
Abstract (English) vii
List of Tables xv
List of Figures xvi
Chapter 1: Review of Antimicrobial Peptides. １
Introduction １
Drug discovery using mixture-based synthetic combinatorial library (SCLs) ３
Antimicrobial Peptides (AMP) ６
Antimicrobial peptide diversity ６
Antimicrobial-peptide-mediated cell killing ９
Mechanisms of bacterial resistance １０
Applications １２
1.2. Literature cited １５
Chapter 2: Identification of Novel Hexapeptides Bioactive against Phytopathogenic Bacteria through Rapid Screening of a Synthetic Combinational Library ２６
2.1. Introduction ２６
2.2. Materials and methods ２８
2.2.1. Microbial strains and Culture conditions ２８
2.2.2. Synthesis of peptide libraries and individual peptides ２８
2.2.3. In vitro antimicrobial activity assay ２９
2.2.4 Minimal effective concentration ３０
2.2.5. Leaf inoculation test ３０
2.2.6 In vitro cytotoxicity test. ３１
2.3. Results ３２
2.3.1. Selection of antimicrobial hexapeptides through screening of a PS-SCL. ３２
2.3.2. Activities comparison of the defined hexapeptides ３４
2.3.3. Activity profiles of the defined hexapeptides ３５
2.3.4. Clear zone assay to address the bacteriocidal activities (MEC) ３６
2.3.5. MTT test to evaluate the cytotoxic effects ３７
2.3.6. In vivo activities of KCM21 ３８
2.4. Discussion ３８
2.5. Acknowledgments ４５
2.6. Literature cited ４６
Chapter 3: Mode of Action of Hexapeptide KCM21 and KCM11 ６３
3.1. Introduction ６３
3.2. Material and Methods ６６
3.2.1 Material ６６
3.2.2. Antimicrobial activities: growth inhibition, MIC and MBC assay, killing curve ６６
3.2.3. Fluorescence and confocal microscopy ６８
3.2.4. Electron microscopy ６９
3.2.5. Cell integrity ７０
3.2.6. Integration of NPN into outer membrane (OM) ７０
3.2.7. Inner membrane (IM) perturbation: β-galactosidase assay ７１
3.2.9. Atomic force microscopy (AFM) ７１
3.2.10. Nuclease activity ７２
3.3. Results ７３
3.3.1. MIC and MBC assay ７３
3.3.2. Effects of temperature on bacteriocidal activity ７３
3.3.3. Effects of D-enantiomer and N-terminal modification with FITC ７４
3.3.4. Internalization and permeation of cell membrane: Fluorescence and confocal microscopy ７５
3.3.5. Effects of divalent cations on the action of KCM21 against 3 different bacterial strains ７６
3.3.6. Effects of divalent cations on the action of 3 hexapeptides against CM ７７
3.3.7. Electron microscopy (SEM and TEM) ７８
3.3.8. Disintegration of bacterial membrane ７９
3.3.9. Outer membrane perturbation ８０
3.3.10. Disturbance of inner membrane monitored by β-galactosidase assay ８１
3.3.11. Atomic force microscopy (AFM) ８２
3.2.12. Nuclease activity ８４
3.3 Literature cited ８６
