줄기 세포를 이용한 척수 질환 치료
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김병곤
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010032
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
The central nervous system (CNS) has long been known to be relatively resistant to regeneration. In recent years, however, the idea of repairing injury or disease of the CNS by introducing new cells into damaged areas has become an accepted treatment strategy. Using various types of stem cells, many studies have shown that transplanted stem cell can migrate to areas of injury, secrete trophic factors, differentiate into mature neural cell types, and, most importantly, improve behavioral recovery in animal models of various CNS diseases. However, there remain many obstacles for stem cell-based therapy that could be overcome by development of therapeutic strategies employing stem cells based upon specific pathophysiology of each disease condition. In this thesis research, I intended to develop therapeutic strategies using immortalized human neural stem cells to treat diseases in the spinal cord, for which there is no available treatment option to improve functional outcomes. The etiology and precise pathogenic mechanisms of the amyotrophic lateral sclerosis (ALS) remain unknown, and there is no effective treatment. Vascular endothelial growth factor (VEGF) has recently been shown to exert direct neurotrophic and neuroprotective effects in animal models of ALS. Here I show that intrathecal transplantation of immortalized human neural stem cells overexpressing human VEGF gene (HB1.F3.VEGF), significantly delayed disease onset and prolonged the survival of SOD1G93A mouse model of ALS. Furthermore, transplanted F3.VEGF cells that express neuronal phenotype (MAP2+) were found in the anterior horn of the spinal cord gray matter indicating that the transplanted human neural stem cells migrated into the gray matter, took the correct structural position, integrated into the spinal cord anterior horn and differentiated into motoneurons. Contusive spinal cord injury (SCI) is complicated by a delayed loss of oligodendrocytes, resulting in chronic progressive demyelination. The second part of the thesis research investigated whether transplantation of human neural stem cells (NSCs) genetically modified to express Olig2, an essential regulator of oligodendrocyte development, transcription factor can improve locomotor recovery and enhance myelination in a rat SCI model. Most of F3.Olig2 NSCs occupying spared white matter differentiated into mature oligodendrocytes. Transplantation of F3.Olig2 NSCs increased the volume of spared white matter and reduced the cavity volume. Moreover, F3.Olig2 grafts significantly increased the thickness of myelin sheath around the axons in spared white matter. Cystic cavities developing after spinal cord injury (SCI) impede regeneration of severed axons. Artificial scaffolds can be implanted to bridge the defects and also function as a carrier to deliver cells and/or growth factors further promoting regeneration. The third part of the thesis research aimed to assess the effects of implanting polycaprolactone (PCL) scaffold seeded with human neural stem cells genetically modified to secrete neurotrophin-3 (F3.NT-3) on recovery of motor function following SCI. The F3.NT-3 hNSCs more frequently migrated towards the host spinal cord than parental hNSCs. Moreover, migrating F3.NT3 hNSCs showed more frequent differentiation into mature neuron. Implantation of PCL scaffold with F3.NT3 hNSCs (PLC-F3.NT3) led to better motor behavior. Electrophysiological recovery was also evaluated using transcranial magnetic motor evoked potentials. Only implantation of PLC-F3.NT3 successfully recovered contralateral MMEPs, suggesting reconstruction of neural circuit in the spinal cord mediating MMEP pathway. I further test a hypothesis that degradation of chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs) at the scaffold-host tissue interface, which restricts axonal growth and cellular migration, can enhance functional recoveries mediated by PLC-F3.NT3. Infusion of Chondroitinase ABC in combination with PCL-F3.NT3 treatment improved the locomotion compared to control penicillinase infusion. Moreover, ipsilateral MMEP responses were recovered only with chondroitinase combination. Profuse axonal outgrowth into PCL scaffolds was observed in animals with chondroitinase treatment, suggesting that degradation of CSPGs at the interface promoted axonal bridging by implanted scaffolds. In the present thesis research, I developed three stem-cell based therapeutic strategies tailored to specific diseases in the spinal cord: 1) intrathecal delivery of NSCs overexpressing VEGF targeting diffuse motoneuron degeneration in ALS, 2) transplantation of NSCs directed to differentiate into oligodendcrocytes using olig2 transcription factors to target demyelination following traumatic spinal cord injury, and 3) combinatorial approach employing polymer scaffold, NT-3 secreting NSCs, and modulation of extracellular matrix molecules to bridge cystic cavities and to reconstruct neural connections of injured spinal cord. Using appropriate disease specific animal models, I demonstrated therapeutic effects of these pathophysiology-specific strategies on anatomical repair and, most importantly, behavioral and electrophysiological recoveries. These studies highlight necessity of developing pathophysiology-specific therapeutic strategies centering in NSCs. Modification of intrinsic properties of NSCs, incorporating therapeutic genes relevant for specific disease conditions, modulation of disease-specific microenvironment, and appropriate combination of these approaches will potentiate therapeutic efficacy of stem cell-based therapy for the diseases in the spinal cord. These exciting lines of researches will bring the dream of regenerating adult human spinal cord afflicted with various diseases much closer to a clinical reality.
more목차
ABSTRACT ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• i
TABLE OF CONTENTS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• v
LIST OF FIGURES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ix
LIST OF TABLES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• xi
LIST OF ABBREVIATION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• xii
I. INTRODUCTION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
A. Stem cell-based treatments for motor neuron diseases •••••••••••••••••••••••••••••••• 5
1. Pathophysiology of Amyotrophic lateral sclerosis •••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
2. Current status of cell-based treatments for ALS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
3. Role of vascular endothelial cell growth factor for ALS treatment ••••••••••••••• 6
B. Cell-based treatments for spinal cord injury •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7
1. Pathophysiology of spinal cord injury •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7
2. Cell-based treatments to enhance remyelination after SCI •••••••••••••••••••••••• 9
3. Combinatorial strategies to induce axonal regeneration •••••••••••••••••••••••••• 11
C. Specific aims of the thesis research •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 13
II. MATERIALS AND METHODS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
Part A. Amyotrophic Lateral Sclerosis •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
1. Culture of human neural stem cells •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
2. Immunocytochemistry in F3.VEGF NSCs ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16
3. Animals and cell transplantation ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
4. Behavioral Testing ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
5. Immunohistochemistry in spinal cord sections ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18
6. Western blot ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
7. Quantitative cell counts ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
8. Statistical Analysis ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
Part B. Spinal cord injury I ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
1. Establishment of human neural stem cells overexpressing Olig2 ••••••••••••••• 21
2. RT-PCR, western blot, and immunocytochemistry in F3.Olig2 NSCs ••••••••• 21
3. Proliferation assay •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
4. Animals and surgery ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 23
5. Assessment of locomotor recovery •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24
6. Histological processing and immunohistochemistry •••••••••••••••••••••••••••••• 26
7. Quantitative cell counting and image analysis ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
8. Statistical methods ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 30
Part C. Spinal cord injury II •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
1. Establishment of human neural stem cells genetically modified to
secrete neurotrophin-3 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
2. Immunocytochemistry in F3.NT3 NSCs •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
3. Pretreatment of scaffold and cell seeding ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
4. Cell survival, Enzyme linked immunosorbent (ELISA) assay of NT-3
inside the scaffold •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 32
5. Scanning electron microscope (SEM) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33
6. Spinal cord injury, implantation of scaffold •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 34
7. Infusion of chondroitinase ABC ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 35
8. In vivo NT-3 expression (ELISA assay) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
9. Assessment of locomotor recovery •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
10. Transcranial magnetic motor evoked potential ••••••••••••••••••••••••••••••••• 37
11. Immunohistochemistry ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 37
12. Quantitative cell counting ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 38
13. Quantification of axons density and regrowth •••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39
14. Statistical methods •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39
III. RESULTS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 40
Part A. Amyotrophic Lateral Sclerosis •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 42
Part B. Spinal cord injury I ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 54
1. Characterization of NSCs transduced with Olig2 transcription factor •••••••••••54
2. Transplantation of NSCs transduced with Olig2 transcription factor into
contused rat spinal cord •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 56
3. Differentiation of F3.Olig2 in the contused spinal cord ••••••••••••••••••••••••••• 63
4. Transplantation of F3.Olig2 NSCs increased the volume of spared white
matter and enhanced tissue sparing •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 67
5. Extent of myelination in spared white matter •••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 69
6. Transplantation of F3.Olig2 NSCs improves locomotor recovery ••••••••••••••• 71
Part C. Spinal cord injury II ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 74
1. Characterization of NT-3 overexpressing hNSCs in PCL Scaffolds •••••••••••••74
2. Implantation of PCL seeded with hNSCs into hemisection of spinal cord ••••• 77
3. Differentiation of F3.NT3 cells in the spinal cord ••••••••••••••••••••••••••••••••• 81
4. Improvement of locomotor recovery following implantation of PCL
scaffold seeded with F3.NT3 cells ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 84
5. Electrophysiological restoration following implantation of PCL
scaffold seeded with F3.NT3 cells ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 87
6. Degradation of proteoglycans enhance axonal regeneration
and migration of transplanted cells ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 90
7. Degradation of proteoglycans enhances behavioral and
electrophysiological recovery ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 98
IV. DISCUSSION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 101
Part A. Amyotrophic Lateral Sclerosis ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 101
Part B. Spinal cord injury I •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 108
Part C. Spinal cord injury II ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 112
V. CONCLUSION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 117
REFERENCES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 120
국문요약 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 145
