Retinoic Acid의 뇌염증조절과 Nucleotides의 뇌염증반응 유도기전에 관한 연구
Studies on the Regulatory Mechanism of Retinoic Acid and Nucleotides in Brain Inflammatory Responses
- 주제(키워드) Brain inflammation , microglia , astrocyte , P2Y6 , all-trans retinoic acid
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 조은혜
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000009707
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Part A: Chemokine들은 뇌 염증반응을 통한 뇌질환과 퇴행성 뇌질환의 발병에 중요한 역할을 담당한다. 위험인자에 대한 반응으로 glia (microglia, astrocytes)들은 chemokine을 생성한다고 알려져 왔다. 그러나, 이들의 생성반응에 대한 연구는 미비한 상태이다. 본 연구에서는 뇌 염증반응에서 중요한 역할을 담당하는 MCP-1 (CCL2) 인자가 P2Y6 활성을 통해 유도될 수 있음을 밝혔다. 배양된 microglia에 UDP를 처리하게 되면, 여러 chemokines들은 microglia는 1시간부터, astrocytes의 경우 12 시간부터 분비의 차이가 발견된다. 다양한 P2Y 수용체 중에 P2Y6에 특이적인 siRNA와 길항제를 통한 연구로P2Y6의 활성이 이 chemokine의 발현에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. P2Y6 신호전달체계인 Gq 수용체를 통한 세포 내 칼슘의 증가 후 PLC가 활성화되는 기전 또한 MCP-1의 생성에 관련됨을 밝혀낼 수 있었다. 그리고, P2Y6의 활성은 세포이동실험을 통해 monocytes를 이동시킬 수 있음을 밝혔다. 게다가, 조직배양을 위한 과정 중에 발생하는 trauma 상해로 인한 염증반응에서 MCP-1이 크게 증가를 하고, 여기에 P2Y6 신호전달체계가 관여됨을 알 수 있었다. 더불어 UDP를 쥐의 대뇌피질에 직접 주사하였을 때에 monocytes 혹은 microglia의 주입부위로의 이동을 관찰할 수 있었다. 다른 nucleotides인 ATP에 의한 자극으로는 chemokine의 mRNA 합성은 유도시킬 수 있지만, 단백질 합성은 이루어지지 않았다. Part B: Retinoic acid (RA)는 잘 알려진 항염증성 물질이다. 여기서 우리는 먼저 활성화된 miroglia에서COX-2의 발현에 있어 두가지 서로 다른 영향을 준다는 것을 밝혔다. LPS나 thrombin과 같은 염증유도물질을 microglia에 처리하게 되면, COX-2의 발현은 두 번에 걸친 증가양상을 보이게 된다. 첫 번째 유도는 12시간 정도에서 나타난 후 감소하며 두 번째 발현유도는 48-72시간 정도에서 나타났다. 반면, PGE2나 15d-PGJ2와 같은 prostagladins의 경우에는 12시간 정도에서 분비가 확인이 되었으며, 시간이 지날수록 축적되는 양상을 관찰할 수 있었다. All-trans retinoic acid (ATRA)는 첫번째 COX-2의 발현은 감소시키고, 두번째 COX-2의 발현은 증가시켰으며, iNOS의 발현은 모든 시간에서 감소가 되는 양상을 발견할 수 있었다. Prostaglandins의 분비에 있어 ATRA는 PGE2의 생성은 증가시키나, 15d-PGJ2의 분비에는 영향을 미치지 못하였다. mPGES-1은 PGE2를 생성시키는 효소로 ATRA에 의해 그 발현이 증가하였으며, 반면 PGD2를 생성시키는 효소 (H-PGDS, L-PGDS)는 ATRA 처리 시에도 모두 발현에 변화가 없었다. 이 결과는 ATRA가 염증유도물질에 대한 microglia의 반응을 조절하며, 특히 뒷시간의 COX-2 발현의 증가는 PGE2의 생성과 관련이 있다는 것을 시사한다.
more목차
ABSTRACT iv
LIST OF CONTENTS vi
FIGURES OF CONTENTS ix
TABLE OF CONTENTS xi
ABBREVIATIONS xii
I. INTRODUCTION 1
A. Brain Inflammation 1
1. Overview of inflammation 1
2. Brain as immune privilege site 4
3. Common things of inflammation between brain and other organs 4
4. Brain diseases and injuries 5
B. Main actors of brain inflammation 8
1. Microglia 9
2. Astrocytes 11
C. Extracellular nucleotides 12
1. Extracellular nucleotides as endogenous inducers of brain inflammation 12
2. Function of purinergic receptor 12
D. Chemokines in brain inflammation 13
1. Chemokines as mediator of brain inflammatory processes 13
2. Importance of MCP-1 in brain inflammation 14
E. Lipid mediators in brain inflammation 15
1. Cyclooxygenase-2 15
2. Modulator of lipid mediator 15
F. Retinoic acid as inflammatory modulator 16
1. Function of retinoic acid 16
2. Possible role of retinoic acid in brain inflammation 17
G. Aims of this study 18
1. Extracellular nucleotides in chemokines production 18
2. Retinoic acid modality in lipid mediator 18
II. MATERIAL AND METHODS 19
A. Reagents 19
B. Cell culture 20
C. Semi-quantitative Reverse Transcripiton-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 20
D. Western Blot Analysis 23
E. Enzyme-Linked Immunoassay (EIA) 23
F. Organotypic cortical culture 24
G. Isolation of blood monocytes and neutrophils from rat 24
H. In vitro transmigration assay 25
I. Nitrite assay 25
J. Stereotaxic Surgery and Drug Injection 26
K. Tissue preparation 26
L. Immunohistochemistry 27
M. Statistical analysis 27
III. RESULTS 28
Part A. UDP induces MCP-1 expression in microglia and astrocytes through the activation of P2Y6 receptor 28
1. Extracellular uridine diphosphate (UDP) induce chemokines expression but not iNOS and COX-2 in cultured microglia 28
2. UDP induces chemokines through the activation and signaling of P2Y6 34
3. UDP induces chemokine expression in cultured astrocytes 34
4. P2Y6 mediates chemokine production from the rat brain cortical slices 40
5. UDP-treated astrocytes recruit monocytes 40
6. UDP-treated astrocytes recruit neutrophils 42
7. UDP injection into brain cortex causes accumulation of Iba-1 positive cells at the injected site injected 47
8. Accumulated cells into the injection site of UDP are positive for ED-1, CD45 50
9. ATP induces mRNA expression, but not protein synthesis, of MCP-1 50
Part B. Retinoic acid enhances PGE2 production through increased expression of cyclooxygenase-2 and microsomal PGE synthase-1 in rat brain microglia 54
1. ATRA has a dual effect on COX-2 expression in activated microglia 54
2. ATRA enhances PGE2 production and mPGES-1 expression, but not 15d-PGJ2 or PGDS in activated microglia 56
3. Enhancing effect of ATRA on the expression of COX-2 and mPGES-1 only required for 1h incubation, but disappeared its effect by post-treatment to activated microglia 60
4. ATRA enhancing COX-2 and mPGES-1 in activated peritoneal macrophage 63
IV. DISCUSSION 65
V. SUMMARY AND CONCLUSION 73
REFERENCE 74
국문요약 93
