백서 피질 신경원에서 AMPA로 유도된 뇌독성에 대한 Propofol의 효과
The effect of propofol on α‐amino‐5‐methyl‐4‐isoxazole propionate(AMPA) induced neurotoxicity in rat mixed cortical cultures
- 주제(키워드) α‐amino‐5‐methyl‐4‐isoxazole propionate(AMPA) , cell death , propofol
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 이숙영
- 발행년도 2008
- 학위수여년월 2008. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
세포손상 주요 기전중 하나로 뇌허혈 시 세포외 glutamate의 급격한 증가는 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 혹은 α-amino-5-methyl-4-isoxazole propionate (AMPA), kainate 수용체 등을 과도하게 흥분시켜 excitotoxic cascade를 활성화시킨다. 그러나, AMPA 수용체 자극 시 어떤 형태의 세포손상이 오는지(necrosis vs apoptosis), AMPA 자극에 대해 propofol의 뇌보호 작용이 있는지, 기전이 무엇인지 등은 여전히 불명확하다. 저자들은 백서(Sprague?Dawley) 피질 신경원 배양 모델에서 AMPA 자극을 주며 어떤 형태의 신경세포 손상을 일으키는지, propofol이 AMPA 자극에 대해 뇌보호 효과가 있는지, propofol이 세포내로의 Ca++ influx에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 백서를 이용하여 피질신경원 혼합배양을 하였으며, 세포배양 시작 13일째 되는 날 실험을 실시하였다. Propofol이 AMPA자극에 대해 뇌보호 효과가 있는지 보기위해 세포들은 아무약도 처리하지 않은 대조군, NMDA 100 μM 처리한 Full-kill군, AMPA 50 μM 처리군, AMPA 50 μM + propofol 0.1, 1, 25, 50 μM 처리군, propofol 50 μM 단독처리군 등으로 나뉘었다. 72 시간 배양후 trypan blue염색을 이용하여 살아있는 세포수를 세었으며, 이를 대조군값 0, Full kill군 값 100으로 놓고 각 군에서의 세포사율을 구하였다. Apoptosis 발생 여부 및 apoptosis에 propofol 투여가 미치는 영향을 보기위해, 대조군, AMPA 50 μM 처리군, AMPA 50 μM + propofol 50 μM 처리군으로 나누었으며, TUNEL assay, NeuN stain, Hoest stain등의 Triple stain을 하여 apoptosis 발생비율을 구하였다. AMPA 자극시의 세포내로의 calcium inflx에 propofol 투여가 미치는 영향을 보기위하여 대조군, AMPA 50 μM 처리군, AMPA 50 μM + propofol 50 μM 처리군으로 나누었으며 confocal 현미경을 이용한 calcium imaging을 실시하였다. 통계는 SPSS 12.0을 이용하여 One?way ANOVA test 실시하였고 사후 검증은 Bonferroni test로 실시하였으며, P < 0.05시 의의있는 것으로 간주하였다. 세포사율은 AMPA 50 μM 단독투여군에서 49.31%, AMPA 50 μM+propofol 50 μM 혼합투여군에서 29.38%로 의의있게 감소하였다(n=45/군)(Fig.1, P<0.05). Triple staining 결과 대조군에 비해 AMPA 50 μM 투여군에서 apoptosis 일으킨 신경원의 수가 의의있게 증가하였다.(12 vs 28 %)(P<0.05) 또한, AMPA 50 μM + propofol 50 μM 혼합투여군에서 apoptosis 일으킨 신경원의 수가 의의있게 감소하였다.(28 vs 20 %)(P<0.05) Calcium imaging결과 AMPA 50 μM 단독투여군에 비해 AMPA 50 + propofol 50 μM 혼합투여군에서 intraneural calcium influx의 최대치는 의의있는 감소를 보였다.(3164.98 nA vs 2276.98 nA)(Fig. 6,7, P<0.05) 결론적으로 백서 피질 신경원 혼합배양 AMPA 자극 시 necrosis와 apoptosis가 혼합된 형태로 추측되는 세포손상을 보였으며, 50 μM propofol의 처치는 뇌세포보호 효과가 있었고, 이는 부분적으로 세포내로의 calcium의 이동의 감소에 기인하는 것으로 사료된다.
more초록/요약
Background: Excessive extracellular glutamate accmulation due to cerebral ischemia is belived to induce excitotoxic cascade by overstimulation of glutamate receptors such as Nmethyl- D-aspartate (NMDA), α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA), and kainite. The pattern of AMPA mediated neurotoxicity (necrosis vs apoptosis) and the neuroprotective effect of propofol to AMPA mediated neurotoxicity still remain unclear. We applied 72 hr, 50 μM AMPA stimulation to cultured rat cortical neurons and have examined the pattern of AMPA neurotoxicity and the neuroprotective effects of propofol. Also, we have examined the effect of propofol on AMPA mediated intraneural calcium influx. Methods: Sprague-Dawley rats (250-300 g) were used. Thirteen-day-old primary mixed cortical cultures were exposed to 50 μM AMPA stimulation (AMPA group). Propofol 0.1, 1, 25, 50, μM were co-administered with 50 μM AMPA (propofol-treated group) or propofol 50 μM alone. In control and Full-kill group, no drug or NMDA 100 μM were administered. 72 hr after, the survived cells were counted using trypan-blue staining. And, the cell death rate (CDR) were calculated (control group CDR set as 0, Full kill group CDR set as 100). After confirming the presence of neuronal cells by neuronal nuclei (NeuN) and Hoechst stain, we quantified apoptotic cells by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end-labeling (TUNEL) assay. The effect of propofol on AMPA mediated intracellular calcium increase was measured with calcium-sensitive fluorochrome calcium green-5N-acetoxymethylester with confocal laser scanning microscopy. Statistical analysis was done by Oneway-ANOVA test and Bonferroni test. P<0.05 was considered as statistically significant. Results: AMPA 50 μM stimulation demonstrated 49.31% CDR and adding propofol 50 μM decreased CDR to 29.38% (P<0.05). In TUNEL assay, cells with no drug treatment demonstrated 12.33% apoptotic cell rate (ACR) and 50 μM AMPA incrcresed ACR to 28.01% (P<0.05). Adding 50 μM propofol to AMPA decreased the ACR to 20% (P<0.05). In calcium imaging, the maximum intracellular calcium influx was decreased in AMPA 50 μM + propofol 50 μM group compared to AMPA 50 μM group (3164.98 nA vs 2276.98 nA, respectively)(P<0.05). Conclusion: 50 μM propofol demonstrated neuroprotective effects against AMPA 50 μM stimulation and the underlying mechanism propofol’s effect may be caused partly by the reduction of the intracellulr calcium influx.
more목차
국문요약 = i
차례 = iii
표차례 = iv
I. 서론 = 1
II. 연구대상 및 방법 = 3
III. 결과 = 9
IV. 고찰 = 18
V. 결론 = 27
참고문헌 = 28
ABSTRACT = 37
