Go 단백질에 의한 Protein Kinase A 신호 전달 경로의 구획화
Compartmentalization of Protein Kinase A Signaling by a Heterotrimeric G Protein, Go
- 주제(키워드) Goα protein , cAMP dependent protein kinase (Protein kinase A , PKA) , β-catenin , cAMP , Rap1 , cAMP response element binding protein (CREB) , Goα knock-out mice , neurological behavior , main olfactory epithelium (MOE) , vomeronasal organ(VNO) , main olfactory bulb (MOB) , accessory olfactory organ (AOB) , pheromone , Goα 단백질 , cAMP-의존성인 단백질 인산화효소 A , Goα 유전자 결핍 생쥐 , 신경학적 행동 , 주후각상피 , 보습코기관 , 주후각망울 , 보조후각망울 , 페로몬
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 서해영
- 발행년도 2008
- 학위수여년월 2008. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
Heterotrimeric G proteins mediate signal transduction generated by hormones and neurotransmitters. Among all G proteins, Go, a member of the Gi/o family, is the most abundant heterotrimeric G protein in brain, being present on both plasma- and endo- membranes. To date all consequences of trimeric Go activation for which there is a mechanistic explanation have been shown to be due to its Gβγ dimmers. Roles and effectors for the Goα subunit have not been clearly defined. Yet, overexpression of Goα has profound effects, including cAMP-induced inhibition of neurite outgrowth, which are unlikely mediated by Gβγ dimmers and suggest existence of unidentified Goα effector(s). In PART I, we showed that Goα interacts directly with cAMP dependent protein kinase (PKA) through its GTPase domain, colocalizes with PKA in membrane fractions, and inhibits nuclear translocation of the catalytic subunit of PKA. These interactions between Goα and PKA-Cα did not block the kinase activity of PKA. As the result, these interaction repressed PKA-mediated-activation of cAMP-responsive element binding protein (CREB) in the nucleus whereas spared phospholyration of β-catanin and activation of Rap1 by PKA in the cytosol. The results indicate that Goα plays a pivotal role in bifurcation of PKA signaling by sequestering the PKA in the membrane/cytosolic compartments. This novel regulatory mechanism of bifurcating PKA signaling by Goα may provide insight into how Goα regulates complex processes such as cell transformation, hypersensitization after prolonged drug treatments, activity-dependent gene expression, and dendritic morphogenesis during synaptic reorganization in neurons. In PART II, we investigated the neurologically abnormal behaviors in Goα knock-out mice. For example, Goα knock-out mice exhibited severe motor control impairment as tested rotarod, open field, elevated plus maze and forced swim tests, as well as a high level of locomotor activity. Ablation of Goα reduced anxiety while increasing more depressiveness. Thus, catalepsy was not induced by haloperidol, a dopamine receptor D2R antagonist, in Goα knock-out mice as found in mice defective in cAMP-PKA signaling pathway including RIIβ, a regulatory subunit of PKA or adenylyl cyclase (AC) 5. Similar behavior deficits found in Goα, RIIβ, and AC5 knock-out mice support our previous in vitro finding that Goα may interact with the catalytic subunit of PKA and modulate its activity, and thereby evoke various PKA-related physiological responses. In PART III, we investigated anatomical alteration of the pheromone-related organs and sexual behaviors in Goα knock-out mice. In most mammals, there are two separated olfactory systems, main olfactory epithelium (MOE) and vomeronasal organ (VNO). We showed the evidence that Go is required for detecting pheromone and evoking sexual behavior. Goα knock-out male mice showed lower frequencies of head-mounting and mounting behavior. In the Goα knock-out male mice, the pheromone sensation was markedly diminished whereas the olfaction was normal. Loss of Goα caused degeneration of cells in the basal layer of VNO as well as their target neurons in the posterior portion of accessory olfactory bulb. Moreover these mice showed additional defects in the MOE. There are no anatomical differences in male reproductive organs, such as testis and seminal vesicles between wild type and Goα knock-out mice. The data suggest that the absence of sexual interaction in Goα knock-out male mice is not due to abnormal development of male reproductive organs nor the male sex hormones, but rather defects in neurological processing that was triggered by pheromones in VNO and MOE.
more초록/요약
G 단백질은 호르몬과 신경 전달물질에 의해서 발생되는 신호를 전달하는 역할을 한다. 모든 G 단백질 중에서 Gi/o 단백질 집단에 속하는 Go 단백질은 뇌조직에 많은 양이 존재한다. 지금까지 보고된 Go의 활성에 관한 많은 결과들은 그들의 Gβγ에 때문이라는 설명을 하고 있지만 Goα를 과발현 시킨 F11 세포에서 cAMP로 분화를 유도하면 신경 돌기의 길이 성장이 억제되는 것과 같이 이러한 Gβγ를 매개하는 것 같지 않은 효과들은 아마도 아직 밝혀지지 않은 Goα의 효과자가 존재할 것을 암시한다. 이 논문의 PART I에서 우리는 Goα가 GTPase 부위를 통해 PKA와 결합하며, 막 분획에서 PKA와 함께 존재하며, PKA의 촉매 소단위체 (catalytic subunit)의 핵 안으로의 전이를 억제함을 관찰하였다. 그러나 이러한 Goα와 PKA-Cα 간의 결합은 PKA의 인산화 활성을 방해하지 않았다. 결론적으로 이러한 결합은 PKA를 매개로 한 핵 안에서의 CREB 활성은 억제하는 반면, 세포질에서 PKA에 의한 β-catenin의 인산화나 Rap1의 활성은 그대로 남겨 두었다. 이러한 결과들은 Goα가 막/세포질 구획에 PKA를 고립시킴으로써 PKA 신호의 갈라짐에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. PKA 신호의 갈라짐에 있어서의 Goα에 의한 새로운 조절 메커니즘은 아마도 세포 변형 (cell transformation), 장기간 약물 처리 후에 나타나는 과민감화 (hypersensitization), 활성 의존적인 유전자의 발현, 그리고 신경 세포에서의 시냅스 재구성 동안의 신경 돌기 형성 (dendritic morphogenesis)과 같은 복잡한 과정을 어떻게 Goα가 조절하는 지에 대한 식견을 제공해 줄 것이다. 이 논문의 PART II에서는 Goα 결여 생쥐에서 관찰되는 신경학적으로 비정상적인 여러 행동들을 조사하였다. 예를 들어, Goα 결여 생쥐들은 다양한 여러 테스트들 (rotarod, open field, elevated plus maze, forced swim 테스트) 에서 심각한 운동 조절의 이상 및 높은 수준의 운동성 (hyperlocomotor)을 보여 주었다. Goα의 결여는 감소된 불안 (anxiety) 및 증가된 우울 (depression)의 경향을 보여주었다. 또한 Goα 결여 생쥐에서는 PKA의 소단위체 중의 하나인 RIIβ 결여 생쥐와 AC 5 결여 생쥐에서 관찰되는 바와 같이 도파민 D2 수용체의 길항제인 haloperidol에 의해 강경증 (catalepsy)이 유도되지 않았다. Goα, RIIβ 그리고 AC5 결여 생쥐들에서 보여지는 비슷한 행동 패턴들은 Goα가 PKA의 catalytic 소단위체와 결합하여 그들의 활성을 조절하며, 그럼으로써 PKA와 관련된 다양한 생리학적인 반응들이 일어나게 된다는 이전의 in vitro 결과를 지지해 준다. 이 논문의 PART III에서는 Goα 결여 생쥐에서 페로몬 관련 기관들의 조직학적 분석 및 성적 행동을 조사하였다. 척추동물에 있어서 페로몬은 다양한 사회적 행동을 촉진하고 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 대부분의 포유류의 후각 시스템에는 서로 분리된 두 기관인 주후각상피 (MOE)와 보습코기관 (VNO)이 존재한다. 고전적으로 보습코기관 (VNO)이 페로몬 감지를 담당하는 특수한 기관으로 인식되어 왔으나, 최근의 논문들에 의하면 주후각기관 (MOE) 역시 페로몬에 의해 조절되는 다양한 행동들과 관련되어 있으며, 보습코기관 (VNO)을 통한 신호전달은 성행동의 시작보다는 오히려 성분별과 관련되어 있다. Goα 결여 생쥐는 암컷과 수컷 모두 새끼를 번식하지 못한다. Goα 결여 수컷 생쥐에서 수컷 특이적인 성행동인 head-mounting과 mounting의 빈도가 현저하게 감소하였다. Goα 결여 생쥐의 후각 능력은 정상적인 반면, 페로몬 지각 능력은 감소하였다. Goα 결여 생쥐에서 Goα의 발현은 보습코기관 (VNO)의 기저층 (basal layer)과 보조후각망울 (AOB)의 후부쪽 (posterior part)에서 사라졌다. 흥미롭게도 Goα 결여 생쥐에서 Goα의 발현이 사라진 이 부분들은 심하게 변질 (degradation) 되었다. 그 외 Goα 결여 생쥐의 주후각기관 (MOE) 세포들의 발생 과정에서도 문제가 있는 것을 확인하였다. 그러나 Goα 결여 생쥐의 정낭 (seminal vesicle), 고환 (testis)과 같은 수컷 생식 기관들은 야생형 (wild-type) 생쥐와의 해부학적인 차이가 발견되지 않았다. 이 결과는 Goα 결여 생쥐에서 관찰되는 성적 행동의 이상은 아마도 수컷 생식 기관의 발생학적인 문제 때문이라기 보다는 페로몬 감지 기관의 이상 때문인 것으로 생각된다.
more목차
ABSTRACT = ⅰ
TABLE OF CONTENTS = ⅳ
LIST OF FIGURES = ⅵ
Ⅰ. INTRODUCTION = 1
Ⅱ. MATERIALS and METHODS = 7
1. GST pulldown assay = 7
2. Co-Immunoprecipitation = 7
3. Fractionation and PKA activity assay = 8
4. GTPase assay = 9
5. Immunocytochemistry = 10
6. Phosphorylation of CREB = 10
7. Magnetic bead capture assay = 11
8. Rap1 activation assay = 11
9. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) = 12
10. Animals = 13
11. Tissue preparation = 13
12. Immunohistochemistry (for VNO and AOB) = 14
13. Hematoxylin and Eosin staining = 15
14. TUNEL staining = 15
15. Behavior test = 16
Ⅲ. RESULTS and DISCUSSIONS = 21
PART I. Compartmentalization of protein kinase A signalling by a heterotrimeric G protein, Go = 21
PART II. Neurological behavior deficits in Goα knock-out mice = 43
PART III. The role of Goα in sexual behavior and signal transduction triggered by pheromones = 57
Ⅳ. CONCLUSIONS = 75
APPENDIX = 77
REFERENCES = 89
국문요약 = 108
