인간 TNF-α 및 중화 단백질 사이의 복합체 형성 및 결합부위 비교 분석 연구
Comparative analyses of copmplex formation and binding sites between TNF-a and its antagonists
- 주제(키워드) Tumor necrosis factor-alpha(TNFα) , 중화 치료법 , TNF-α 중화 단백질
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2008
- 학위수여년월 2008. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)-blocking therapy, using biologic TNF-α antagonists, has been approved for the treatment of several diseases including rheumatoid arthritis, psoriasis and Crohn’s disease. There have been few detailed studies of binding characterizations for the complex formation by TNF-α and clinically relevant antagonists, particularly Infliximab (Remicade) and Etanercept (Enbrel). Here we characterized the binding stoichiometry and size of soluble TNF-α-antagonist complexes and identified energetically important binding sites on TNF-α for the three antagonists, Etanercept, Infliximab, and the recently developed humanized TNF-α neutralizing monoclonal antibody, YHB1411-2. Size-exclusion chromatography and dynamic light scattering analyses revealed that the three antagonists formed distinct thermodynamically stable TNF-α-antagonist complexes that exhibited differences in their size and composition. Energetically important binding residues on TNF-α were identified for each antagonist by a sequence of experiments that consisted of competition binding assays, fragmentations, loop mutations, and single-point mutations using yeast surface-displayed TNF-α, which was further confirmed for solubly purified TNF-α mutants by surface plasmon resonance technique. Analyses of the binding geometry based on binding site location, spatial constraints, and valency satisfaction allowed us to interpretthe thermodynamically stable complexes as follows: one molecule of Etanercept and one molecule of trimeric TNF-α (Etanercept1-TNF-α1), Infliximab6-TNF-α3, and YHB1411-24-TNF-α2. The distinct features of the soluble antagonist-TNF-α complex formation among the antagonists may give further insights into their different neutralizing mechanisms and pharmacokinetic profiles.
more초록/요약
TNF-α 중화 단백질을 통한 Tumor necrosis factor-alpha (TNFα)의 중화 치료법은 류마티스 관절염, psoriasis 그리고 Crohn's disease 등과 같은 여러 자가면역질환의 치료에 있어 큰 실효를 거두고 있다. 그러나 임상적으로 승인된 TNF-α 중화 단백질, 특히 Etanercept(Enbrel),, Infliximab(Remicade) 와 TNF-α 간의 복합체에 대해서 항원 결합부위 및 결합 특성에 관한 연구는 많이 진행되지 않고 있다. 본 연구에서는 TNF-α 중화 단백질 (Etanercept, Infliximab, 및 YHB1411-2) 의 TNF-α에 대한 항원 결정 부위를 밝혀내었고, 최초로 그 복합체의 binding stoichiometry 및 그 size 를 규명하였다. 세 중화 단백질의 TNF-α 에 대한 결합 부위는 순차적인 실험, 즉, 경쟁적 결합 실험, 효모세포 표면에 발현된 TNF-α를 이용한 fragmentations, loop mutations, 그리고 single-point mutations 에 관한 실험을 통하여 밝혀내었고, 그 후 surface plasmon resonance 기술을 사용, soluble 하게 정제된 TNF-α 변이체를 통해 다시한번 그 결합 부위를 검증하였다. Size-exclusion chromatography 와 dynamic light scattering 을 통한 분석 실험을 통해서는 3가지 중화 단백질이 TNF-α 와 그 크기와 조성에 있어서 서로 다른 형태의 열역학적으로 안정한 복합체를 이루고 있다는 것 또한 밝혀내었다. 항원 결정 부위에 관한 실험과 항원-항체 복합체에 관한 실험에 근거한 binding geometry 분석을 통하여 한 분자의 Etanercept 과 한 분자의 trimeric TNF-α, 6 분자의 Infliximab 와 3 분자의 trimeric TNF-α, 그리고 4 분자의 YHB1411-2 와 2 분자의 trimeric TNF-α 가 열역학적으로 가장 안정하게 결합한다는 것을 알 수 있었다. Soluble 상태에서 TNF-α 중화 단백질과 TNF-α 복합체의 고유한 특성은 세 가지 TNF-α 중화 단백질들의 TNF-α 중화 작용과 pharmacokinetic profiles 을 이해하는데 있어 큰 공헌을 하리라 예상된다.
more목차
감사의 글 = ⅲ
국문요약 = ⅳ
List of Tables = ⅴ
List of Figures = ⅵ
Abbreviation = ⅶ
I. 서론 = 1
1. Tumor necrosis factor alpha = 1
2. Tumor necrosis factor alpha antagonists = 4
3. Epitope mapping strategy = 7
4. 연구 목적 = 9
Ⅱ. 재료 및 방법 = 10
1. 시료 및 시약 = 10
2. 실험 방법 = 10
2-1. TNF-α 및 TNF-α fragments 의 효모세포 표면 발현 = 10
2-1-1. TNF-α 의 효모세포 표면 발현 = 10
2-1-2. TNF-α fragments 의 효모세포 표면 발현 = 11
2-2. TNF-α 중화 단백질의 항원결합 부위 (epitope) 결정 = 13
2-2-1. TNF-α의 TNF-α 중화 단백질에 대한 항원결합 부위의 형태 결정 = 13
2-2-2. TNF-α 중화 단백질간의 경쟁적 결합 = 13
2-2-3. TNF-α loop mutants 제작 과정 = 14
2-2-4. Site-directed mutagenesis 를 통한 TNF-α point mutants 제작 과정 = 15
2-3. FACS 를 이용한 TNF-α 와 TNF-α 중화 단백질 간 결합 친화도 측정 = 16
2-4. TNF-α 및 TNF-α points mutants 의 발현 및 정제 = 16
2-5. SPR을 이용한 TNF-α 와 TNF-α 중화 단백질 간 결합 친화도 측정 = 16
2-6. TNF-α 중화 단백질과 TNF-α 간 복합체 특성 분석 = 17
2-6-1. SEC 을 이용한 TNF-α 중화 단백질과 TNF-α 간 복합체 특성 분석 = 17
2-6-2. DLS 를 이용한 TNF-α 중화 단백질과 TNF-α 간 복합체 특성 분석 = 18
Ⅲ. 결과 및 고찰 = 19
1. TNF-α 및 TNF-α fragments 의 효모세포 표면 발현 및 그 결합 친화도 분석 = 19
2. TNF-α 중화 단백질의 항원결합 부위 결정 및 결합 특성분석 = 22
2-1. TNF-α의 중화 단백질에 대한 항원결정 부위의 형태에 대한 분석 = 22
2-2. 효모세포 표면에 발현된 TNF-α 에 대한 TNF-α 중화 단백질의 경쟁적 결합 특성 분석 = 24
2-3. 효모세포 표면에 발현된 TNF-α loop mutants 에 대한 TNF-α 중화 단백질의 결합 친화도 분석 = 27
2-4. Site-directed mutagenesis 를 통한 인TNF-α 중화 단백질의 항원결합 특성분석 = 29
3. SPR 을 이용한 TNF-α 와 TNF-α 중화 단백질 간 결합 친화도에 대한 분석 = 32
4. SEC 와 DLS 를 이용한 TNF-α 중화 단백질과 TNF-α 간 복합체 특성 분석 = 35
4-1. Etanercept : TNF-α = 35
4-2. Infliximab : TNF-α = 36
4-3. YHB1411-2 : TNF-α = 37
Ⅳ. 결론 = 42
Ⅴ. 참고문헌 = 45
Abstract = 49
Appendix = 50
