삼차원 배양에서 토끼 중간엽줄기세포의 연골세포 분화에 초음파 자극이 미치는 영향
초록/요약
배경 및 목적: 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포는 특별한 분화 환경 에서 뼈, 연골, 지방, 근육 등의 다양한 조직으로 분화할 수 있는 잠재력 을 지니고 가지고 있다. 또한 연골화 분화유도를 위한 여러 가지 환경으 로는 삼차원 배양과 다양한 성장 인자, 효과적인 기계적인 자극이 있다. 이러한 연골화 분화에 대한 효과에 대한 정확한 기전은 아직까지 알려진 바는 없지만, 현재까지 연골화 분화에 가장 효과적인 배양 환경으로는 3 차원적인 배양과 TGF-B로 알려져 있다. 최근, 저강도 초음파는 조직 내의 세포를 기계적으로 자극시킬 수 있는 수단으로 연골화 분화를 통한 뼈의 생장, 골절, 근육 조직의 치유 등 손상된 조직의 수복에 효과적이라 알려 진 바 있으며, 특히 골절의 수복에 있어서 연골 세포의 증식을 촉진하여 골 유합을 촉진시킨다 하였다. 따라서 저강도 초음파는 중간엽 줄기세포 의 연골화 분화 유도에 중요한 요소 중 하나라고 할 수 있다. 이에 본 연 구에서는 중간엽 줄기세포의 연골화 분화 유도에 저강도 초음파의 효과에 대해서 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 생후 2~3주의 중량이 약 200g정도인 토끼 골수에서 중간엽 줄기세포를 획득하여 사용하였으며, 연골화분화의 유도에 쓰이는 삼차원 배양 중 alginate 배양을 하여 각각 다른 배양 조건에서 초음파를 처리하 였다. 중간엽 줄기세포의 연골화 분화를 유도하기 위하여 alginate 배양을 하면서 TGF-B1 또는 TGF-B3를 연골화 분화에 효과적으로 알려진 배양액 을 공급하였다. 초음파 자극은 12시간마다 10분씩 처리하였으며, 1MHz의 주파수로 0, 200mW/cm2의 강도로 처리하였다. 분석 방법은 RT-PCR과 Westerm blot을 시행하여 중간엽 줄기세포의 연골화 분화에 특이적인 type II collagen과 aggrecan의 발현 양상을 관찰하였다. 결과: 1. 저강도 초음파 처리된 중간엽 줄기세포의 생존율은 대조군에 비해 약 30%가 증가하였다. 2. 중간엽 줄기세포의 연골화 분화 유도에 효과적인 성장인자를 알아보기 위하여 TGF-B1과 TGF-B3를 처리하여 비교한 결과, type Il collagen의 발 현에 TGF-B1보다는 TGF-B3가 더 효과적이었다. 3. 초음파와 TGF-B3를 같이 처리를 해주었을 때 type Il collagen의 발현이 더욱 증가하였으며, 배양 초기에는 초음파가 type I collagen의 발현에 미 비한 효과를 보이는 듯하나 배양 시간이 지날수록 type I collagen의 발현 이 초음파 처리 시 감소하였다. 4. TIMP-2는 TGF-B3와 초음파를 같이 처리해주었을 경우 발현이 되었으며, MMP-1의 발현은 어느 실험군에서도 발현되지 않았다. 결론: 이상의 결과에서 각각 배양 조건에 따른 저강도 초음파의 효과를 관찰할 수 있었으며, 이것을 바탕으로 연골세포를 목적에 따라 이용함에 있어서 적절히 조절하여 사용할 수 있는 근거를 마련하였으며, 궁극적으 로는 임상적인 치료에 직접적으로 이용할 수 있을 것이다.
more목차
1. 서론 1
1) 연골 재생을 위한 새로운 시도 1
2) 줄기세포의 이용 2
3) 배양조건의 선택 5
4) 물리적 자극 6
2. 실험 재료 및 방법 8
1) 실험동물 및 재료 8
2) 세포 분리 및 배양 8
3) Alginate bead 제조 및 배양법 9
4) 초음파 자극 10
5) Alginate 삼차원 배양으로부터의 생존율 측정 10
6) Total RNA 분리 13
7) RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 13
8) Western blot 분석 16
9) 조직학적 염색 17
10) 면역조직화학적 검사 19
3. 실험 결과 21
1) alginate 삼차원 배양으로부터의 생존율 측정 21
2) 총 RNA 분리 23
3) PT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 25
4) Western blot 분석 27
5) 조직학적 검사 31
6) 면역조직화학적 검사 34
4. 고찰 36
5. 결론 41
참고문헌 42
영문요약 52
