Fibrin-Hyaluronate Composite을 이용한 인공 연골 조직 제작
Tissue-Engineered Cartllage Formation Using Fibrin-Hyaluronate Composite
초록/요약
관절 연골의 재생을 위해서 자가 연골 세포를 접종한 다양한 생분해성 세포 전달 지지체를 이식하여 치료하는데 성공적인 결과를 보이고 있다. 세포 지지체는 합성 지지체와 천연 지지체로 나뉠 수 있는데 합성 지지체에 서 발생할 수 있는 여러 가지 단점을 극복하기 위해 천연 지지체에 대한 많 은 연구가 진행되고 있다. 천연 지지체 중 Fibrin은 다양한 생물학적 친화성과 세포외 기질 생성을 위 해 세포 전달 지지체로서 많은 연구 결과가 보고 되고 있으며 hyaluronate (HA)도 초자 연골에 중요한 구성 물질이면서 연골 세포의 3차원 배양에 생물학적 지지체로 널리 연구 되어져 왔다. 본 연구에서는 fibrin의 생물학적 지지체로서의 장점을 유지하고 조기 분해 되는 단점을 극복하기 위해 HA와 분해 지연 인자에 의해 구조적으로 안정화 된 fibrin gel을 개발하고 세포 전달 지지체로서의 유용성과 연골 조직 재생 조직 공학을 위한 지지체로서의 가능성을 연구하였다. | fibrin은 HA와 혼합됨으로써 실험실적 조건에서 지지체내에 연골 세포의 균등한 분포와 세포외 기질의 합성이 촉진됨을 볼 수 있었고 분해가 지연되 었으며 분해 지연 인자를 첨가 하였을 때 이 더욱 분해가 지연되었다. 연골 세포가 포함된 fibrin 과 fibrin-HA 복합 지지체를 누드 마우스의 피 하에 이식하여 1주, 2주, 4주 기간에 연골 세포에 미치는 영향을 살펴 보았 고, fibrin 분해 억제제인 분해 지연 인자를 첨가하여 fibrin-HA 복합 지지체 가 fibrin에 효과적인지 살펴 보았다. 그 결과 fibrin- HA 지지체는 fibrin 지지체보다 분해가 지연되었으며 분해 지연 인자를 첨가하였을 때 이 현상은 더욱 두드러졌다. 또한 fibrin 지지체에 세포를 추가할 경우에 비해 fibrin-HA에 세포를 추가한 경우에 연골 조직의 형성이 더욱 왕성하였다. 유사한 생체내 조건에서의 실험을 위하여 New Zealand white rabbit의 연골과 뼈에 지름 5mm, 깊이 3mm의 결손을 만들어 실험군의 결손 부위는 연골 세포가 포함되어 있는 fibrin-HA 복합 지지체로 채우고, 대조군의 상처 부위는 fibrin-HA 복합 지지체로만 채웠다. 이식 후 1달, 2달, 3달 후에 각 군마다 3마리의 토끼를 희생시켜 결손 부위를 얻은 후 조직학적 검사를 실시 하였다. 연골세포-fibrin-HA 지지체 이식 군에서 연골 조직의 재생이 연골 세포 -fibrin 지지체 이식군보다 좀 더 효과적이었다. 또한 첨가된 분해 지연 인자 는 fibrin 지지체에 효과적이었으나 fibrin-HA 복합 지지체에서 더 좋은 효과를 보였다. 따라서, fibrin-HA-분해 지연제는 연골 세포의 전달 지지체로서 유용성을 갖고 있으며, 이러한 결과들은 fibrin과 HA를 사용함으로서 조직 공학적 연골 재생의 가시화를 증명해 주었다
more목차
서론 1
실험 재료 및 방법 6
A. 재료 6
1. 실험 동물 6
2. 실험 재료 7
B. 방법 10
1. 세포 분리 및 배양 10
2. 생분해성 고분자 지지체 준비 과정 11
3. Fabrinogen-HA 지지체에 세포 접종 11
4. 실험실 배양 12
5. 동물 이식 방법 12
5.1 Nude mouse 이식 12
5.2 Rabbit 이식 13
6. 분석 16
6.1 조직학적 검사(histology) 16
6.1.1 H&E 염색 17
6.1.2 Safranin-O 염색 17
6.1.3 AB(alcian blue)-PAS 염색 18
6.2 면역조직화학적 검사(immunohistochemistry) 19
6.3 생화학적 분석(biochemical assay) 20
6.3.1 Collagen 염색 20
6.3.2 Proteoglycan 염색 20
6.4 Live/Dead Viability/Cytotoxicity assat 21
6.5 주사전자현미경 (scanning electron micoscope) 21
결과 22
In vitro experiment 22
1. 지지체와 혼합된 연골 세포의 생존과 분포 22
1.1 연골세포 22
1.2 Fibrin, Fibrin-HA 지지체에서 연골 세포의 형태 22
1.3 연골 세포와 혼합된 fibrin, fibrin-HA 지지체의 전자 현미경적 관찰 23
1.4 지지체에서의 세포 생존 23
2. 연골 세포가 혼합된 fibrin 지지체와 fibrin + HA 지지체의 비교 26
2.1 육안적 검사 26
2.2 조직학적 검사 26
3.fibrin-HA 지지체에 분해 지연 인자 첨가후 결과 29
3.1 육안적 검사 29
3.2 조직학적 염색 결과 29
In vivo experiment1 35
4. 세포와 혼합된 fibrin과 fibrin-HA의 이식 35
4.1 육안적 소견 35
4.2 조직학적 결과 37
5. 분해 지연제가 첨가된fibrin과 fibrin-HA 지지체의 이식 39
5.1 육안적 검사 39
5.2 조직학적 결과 41
5.3 생화학적 검사 결과 43
In vivo experiment2 45
6. Rabbit 실험 45
6.1 육안적 소견 45
6.2 조직학적 결과 48
6.3 O`Driscoll scoring 50
고찰 53
요약 60
결론 61
참고 문헌 62
Abstract 71
