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인간 열충격 단백질-60에 대한 인간 단클론 항체 Fab의 기능 연구

Studies on the Function of Human Anti-HSP60 Monoclonal Antibody Fab

초록/요약

목적 : 열충격 단백질(Heat Shock Protein; HSP)은 원핵 세포과 진핵 세포에서 발현된다. 열충격 단백질은 단백질이 합성될 때 올바른 접힘을 돕는 chaperone의 역할을 하며 분자량에 따라 나뉠 수 있다. 그 중에서 열충격 단백질-60은 열과 같은 충격에 의하여 미토콘드리아 내에서 발현 양이 증가되고, 세포 표면에서도 발현될 수 있다. 열충격 단백질-60은 다양한 미생물질에 의한 선천적 면역 체계 활성체 및 염증 반응 자극제로서 작용한다고 알려졌다. 인간 재조합 열충격 단백질-60은 면역 세포에서 염증 반응을 유도한다. 즉, 부착분자 (adhesion molecule)의 발현과 종양 괴사 인자-alpha (TNF-a)와 인터루킨-6 (IL-6)와 같은 염증 매개체의 유도와 nitric oxide (NO)등의 방출을 증가시키며, Th-1 촉진 싸이토카인 인터루킨-12 (IL-12)와 인터루킨-15 (IL-15)의 유전자 발현을 유도한다. 이러한 염증 반응의 촉진을 통하여 열충격 단백질-60은 조직손상과 염증성 질환을 유도한다. 본 연구실에서는 선행 연구로 파아지 디스플레이 (phage display) 기법을 이용하여 인간 재조합 항-열충격 단백질-60에 대한 단클론 항체 Fab (HSP60-45)를 제작하였다. 본 연구에서는 HSP60-45 항체가 HSP60에 의하여 자극을 받은 대식세포에 의하여 방출되는 종양 괴사 인자-a, 인터루킨-6, NO의 방출 양상에 미치는 영향 분석을 통하여, 이 항체의 염증 반응 조절에서의 잠재적 기능을 연구하고자 하였다. 재료 및 방법 : 항-열충격단백질-60 Fab 클론, HSP60-45를 박테리아에서 발현시킨 후, Ni-NTA agarose 친화성 크로마토그래피를 이용하여 용해성 Fab를 순수 정제하였다. 정제된 HSP60-45가 열충격 단백질-60의 대식세포로의 결합 (binding)과 섭취 (uptake)에 어떠한 영향을 미치는지 유세포 형광분석기 (FACS)와 형광현미경으로 관찰하였다. 인간 열충격 단백질-60가 대식세포를 자극하여 염증 유도 물질 (proinflammatory mediator; TNF-a, IL-6, NO)들의 유도와 이러한 물질 유도에 HSP60-45가 어떠한 영향을 미치는지를 각각 ELISA를 이용하여 측정하여 분석하였다. 결과 : 열충격 단백질-60이 농도 의존적으로 대식세포에 결합 (binding)하고 세포 안으로 섭취 (uptake) 되었고, HSP60-45는 열충격 단백질-60이 대식세포에 결합하고 섭취되는 것을 농도 의존적으로 억제하였다. HSP60-45에 의한 열충격 단백질의 대식세포로의 섭취 억제를 형광현미경으로 분석한 결과, 이 항체에 의한 섭취억제는 열충격 단백질-60에 특이적인 반응임이 확인되었다. 또한 HSP60-45는 열충격 단백질-60 자극에 의해 대식세포로부터 유도되는 종양 괴사 인자-a, 인터루킨-6, 그리고 NO의 생산 정도를 농도 의존적으로 억제하였다. 결론 : 여러 연구에서 알려져 있는 바와 같이 열충격 단백질-60이 대식세포에 결합하고 섭취되며 염증 유도 매개 물질을 유도하는 것이 확인 되었고, HSP60-45가 이러한 열충격 단백질-60의 대식세포에서의 염증 반응 유도 활성을 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있는 것을 in vitro 세포 실험에서 확인하였다. 따라서, 인간 단클론 HSP60-45 Fab가 염증성 질환에 임상적으로 응용될 수 있을지를 추후 in vivo 동물 실험을 통하여 밝혀야 될 것이라고 제안한다.

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목차

국문요약 i
차 례 iv
그림차례 iiiv
I 서 론 1
II 재료 및 방법 - 4
A. 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 생산 및 순수 정제 - 4
1. 재조합 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 DNA를 TOP10F` 세포로 형질 전환 - 4
2. IPTG 예민성 클론 선별 - 4
3. 용해성 Fab 발현 및 periplasmic soluble extract의 분리 - 5
4. 용해성 Fab 정제 - 5
5. SDS-PAGE & Immunoblotting - 6
B. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 결합과 섭취에 미치는 인간 단클론 HSP60-45항체 Fab의 효과 분석 - 6
1. 세포 배양 - 6
2. 열충격 단백질-60의 형광표지 - 7
3. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 결합 분석 - 8
4. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 결합을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 결합 저해 효과 분석 - 8
5. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 섭취 분석 - 8
6. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 섭취를 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 섭취 저해 효과 분석 - 9
7. 형광현미경을 이용한 HSP60-45 항체 Fab의 항원 특이적 억제 효과 - 9
C. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 pro-inflammatory cytokines 유도에 미치는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 10
1. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 TNF-a 생산 - 10
2. 대식세포에서 열충격 단백질-60에 의한 TNF-a 생산을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45항체 Fab의 효과 분석 - 10
3. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 IL-6 생산 - 11
4. 대식세포에서의 열충격 단백질-60에 의한 IL-6 생산을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 12
5. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 nitric oxide 생산 - 12
6. 대식세포에서의 열충격 단백질-60에 의한 nitric oxide 생산을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 13
7. 열충격 단백질-60의 대식세포에서의 생물학적 활성이 dotoxin 오염의 영향인지를 확인 - 13
III 결 과 - 14
A. 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 분리 정제 및 확인 - 14
B. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 결합과 섭취에 미치는 인간 단클론HSP60-45항체 Fab의 효과 분석 - 16
1. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 결합 분석 - 16
2. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 결합을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 16
3. 대식세포에서 열충격 단백질-60의 섭취 분석 - 17
4. 대식세포에서 열충격 단백질-60 섭취를 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 17
5. 형광현미경을 이용한 HSP60-45 항체 Fab의 항원 특이적 억제 효과 - 23
C. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 pro-inflammatory cytokines 유도에 미치는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 26
1. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 TNF-a 생산 - 26
2. 대식세포에서 열충격 단백질-60에 의한 TNF-a 생산을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45항체 Fab의 효과 분석 - 26
3. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 IL-6 생산 - 27
4. 대식세포에서의 열충격 단백질-60에 의한 IL-6 생산을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 28
5. 열충격 단백질-60에 의한 대식세포에서의 nitric oxide 생산 - 28
6. 대식세포에서의 열충격 단백질-60에 의한 nitric oxide 생산을 억제하는 인간 단클론 HSP60-45 항체 Fab의 효과 분석 - 29
7. 열충격 단백질-60의 대식세포에서의 생물학적 활성이 endotoxin 오염의 영향인지를 확인 - 29
IV. 고 찰 - 39
V. 결 론 - 41
참고 문헌 - 42
ABSTRACT - 47

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