뇌출혈과 척수 손상 동물모델에서 Bcl-XL 과발현 인간신경줄기세포의 치료효과
Therapeutic Effects of Bcl-XL Overexpressing Human Neural Stem Cells in Animal Models of Cerebral Hemorrhage and Spinal Cord Injury
- 주제(키워드) Bcl-XL , transplantation , brain transplantation , cell survival , contusive spinal cord injury
- 주제(KDC) 511
- 주제(DDC) 612
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 김승업, 김병곤
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
신경줄기세포를 이용한 치료는 여러 신경질환동물모델에 적용되어 왔으나 이식한 세포 대부분이 apoptosis에 의해 사멸하는 문제점을 가지고 있다. 본 학위 연구에서는 apoptosis를 저해하는 유전자인 Bcl-XL를 인간신경줄기세포에 과 발현 시켜 이식 후 세포의 생존 률을 높이고 이에 따른 이식세포의 분화양상과 행동학적 기능의 향상여부를 관찰하였다. In vitro 에서 인간신경줄기세포에 retrovirus를 이용하여 인간 Bcl-XL gene을 과 발현 시켜 세포주를 만들었다. 이러한 세포 주는 RT-PCR과 immunocytochemistry를 통해 neural stem cell 의 성격 및 분화 양상이 그대로 유지되고 있는 것을 확인하였다. Bcl-XL을 과발현시킨 신경세포가 세포사에 대한 저항력을 가지는 알아보기 위하여 STP를 처리하였고 약 12시간째부터 생존률이 현저하게 높은 것을 확인 하였다. Bcl-XL 과발현한 신경줄기세포가 in vivo 에서 생존률이 얼마나 차이가 나는지 보고자 정상 rat brain에 이식하여 이식 1주 후에는 29%가 3주후에는 56%가 차이가 나는 것을 확인하였으며 이들은 striatum, cortex, corpus callosum 에 분포하고 있는 것을 eGFP stain을 통하여 확인하였다. Collagenase Ⅶ을 사용하여 intracerebral hemorrhage model를 만들고 7일 후 신경줄기세포를 이식하여 1주와 3주 후에 injury 부분으로 세포들이 이동한 것을 확인하였다. 3주 후에는 생존 률이 약 40%정도 차이가 났으며 neurofilament(NF) 염색 통하여 이식한 세포가 신경세포로의 분화 가능성을 확인 하였고, rotarod test에 의해서 신경학적 기능이 많이 호전되었음을 알 수 있었다. Contusive spinal cord injury model에 Bcl-XL 과발현한 신경줄기세포를 이식 후 손상부위로 세포가 이동하는 것을 관찰하였으며, 생존률이 F3에 비해 열배 정도 높은 것을 human mitochondria 염색을 실시하여 확인하였다. BBB, Grid, Foot print analysis 를 실시하여 locomotor recovery가 향상 된 것을 확인하였으며, 이러한 호전은 이식 세포의 분화에 의한 것이라기 보다는 이식 세포가 cellular scaffolder 로써 axon의 재생에 영향을 주었기 때문이라고 생각하게 되었다. 그 이유는 immunohistochemistry를 통해 확인한 결과 분화한 세포들이 많지 않았음에도 불구하고 locomotor recovery 가 향상 되었기 때문이다. 이것을 뒷받침해주는 결과로 손상부위로 이동한 세포들이 모여있는 곳으로 host의 axon이 지나가는 것을 NF 염색으로 확인하였고 5-HT 염색을 통해서 host axon과 이식한 세포 사이의 association 이 이루어져 host axon의 traversing을 유도하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 retrograde tracer 인 fluorogold를 사용하여 lumbar spinal cord와 red nucleus 사이의 axonal connection를 보았는데 역시 Bcl-XL 과발현한 신경줄기세포주를 이식한 그룹에서 FG labled rubrospinal neurons이 4배정도 많은 것을 확인 하였다. Bcl-XL를 과발현한 신경줄기세포주는 이식 후 apoptosis에 의한 세포사에 저항력을 가져 생존 률이 높았으며 생존세포가 늘어난 것에 의한 행동학적 기능도 향상된 것을 intracerebral hemorrhage model과 spinal cord injury model에서 관찰 할 수 있었다. 본 연구에서는 이식세포의 분화률이 높지 않았음에도 불구하고 행동 학적 기능이 향상된 것을 확인 할 수 있었는데, minocycline(염증반응 억제), neurotropic fatctor인 GDNF 등과 같은 coeffector 를 처리하여 이식한 세포의 분화률을 높인다면 좀더 나은 결과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
more초록/요약
Neural stem cells (NSCs) with self-renewal and multilineage differentiation properties would facilitate development of stem cell-based therapy for human neurological disorders. When transplanted NSCs into the diseased CNS, however, a large number of the implanted NSCs die mostly by apoptotic cell death. To overcome this limit of cell replacement therapy with NSCs, immortalized human NSC (hNSC) line overexpressing human Bcl-XL gene (F3.Bcl-XL) was generated via transfection with a retroviral vector encoding human Bcl-XL cDNA. Bcl-XL is an anti apoptotic member of the Bcl-2 gene family, which opposes mitochondrially triggered apoptotic cascade. To determine whether overexpression of Bcl-XL confers resistance to apoptotic cell death, the hNSCs were exposed to pan kinase inhibitor staurosporine. A significantly higher number of F3.Bcl-XL hNSCs survived staurosporine-induced apoptosis in vitro as compared to that of parental hNSCs (F3). Further studies examined therapeutic potential of the Bcl-XL overexpressing hNSCs in rodent models of intracerebral hemorrhage (ICH) and spinal cord injury (SCI). ICH is the second most common cause of stroke and develops a sudden onset of focal neurologic dysfunction. Following transplantation into the brain of collagenase-induced ICH model, the number of surviving F3.Bcl-XL hNSCs was significantly higher than that of F3 hNSCs without overexpression of Bcl-XL. At 3 weeks post-transplantation, neurofilament-positive Bcl-XL overexpressing hNSCs migrated from the original injection sites, localized at the boundary of lesion cavity and showed a close association with neurofilament-positive cells in the host brain. The increase in survival rate of grafted hNSCs in the animals with F3.Bcl-XL hNSCs was accompanied by behavioral improvement as assessed by rotarod test. Spinal cord injury (SCI) leads to a loss of neural cells at the injury site and results in a disruption of axonal connections between the spinal cord and brain motor centers. Transplantation of neural stem cells (NSCs) potentially replace lost cells and promote axonal regeneration following SCI. When transplanted into the injured spinal cord, NSCs migrated to the injury epicenter and integrated within the injured spinal cord tissue by 2 weeks after the initial injury. The number of surviving hNSCs sharply dropped at 7 weeks, and overexpression of Bcl-XL dramatically increased the number of surviving hNSCs cells at 7 weeks. The increased survival of transplanted NSCs was accompanied by enhanced locomotor recovery in animals with transplantation of F3.Bcl-XL hNSCs. Some of the surviving hNSCs differentiated into GFAP positive astrocytes, while very few hNSCs expressed neuronal phenotypes. Many surviving hNSCs were located in close association with the axons traversing the injury site, suggesting that hNSCs may act as cellular guidance to promote axonal regeneration. Retrograde tracing confirmed the enhanced regeneration of the rubrospinal axons by transplantation of F3.Bcl-XL hNSCs. The experiments in this thesis research demonstrated that improving survival of transplanted hNSCs by genetic modification with prosurvival gene Bcl-XL leads to an enhanced functional recovery and anatomical regeneration. These results suggest that a prosurvival strategy should be combined with cellular transplantation to improve efficiency of the future NSC-based therapy for various neurological disorders such as ICH and SCI.
more목차
Introduction = 1
PART Ⅰ Generation of overexpressing Bcl-XL gene human neural stem cells by retroviral transduction = 5
Introduction = 6
Materials and methods = 7
Results = 9
Discussion = 11
Figures = 13
Tables = 18
PART Ⅱ Human neural stem cells transduced with Bcl-XL gene improve neuronal survival in rat and mouse stroke model with intracerebal hemorrhage stroke = 19
Introduction = 20
Materials and methods = 22
Results = 25
Discussion = 27
Figures = 30
PART Ⅲ Overexpression of Bcl-XL promotes survival of transplanted human neural stem cells and graft-mediated locomotor recovery in rat spinal cord injury model = 37
Introduction = 38
Materials and methods = 40
Results = 44
Discussion = 48
Figures = 52
DIscussion = 65
References = 69
국문요약 = 79
