Glucose oxidase가 표지된 항체를 이용한 경쟁적 면역분석 바이오센서의 개발
Development of a competitive immunosensor by using glucose oxidase-tagged antibody
- 주제(키워드) immunosensor , 효소반응 , 면역센서 , mixed monolayer , 항체
- 주제(KDC) 472
- 주제(DDC) 571
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 윤현철
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
효소반응에 의한 전기화학적 신호를 이용한 면역센서를 개발하였다. 이를 위해 전기화학적인 신호의 정확성을 높이기 위해 비특이적 결합이 적고 전기화학적인 신호증폭이 용이한 전극 표면을 제조하였다. 전자의 수송을 원활히 할 수 있는 PAMAM G4 덴드리머와 말단에 hydroxyl기를 가지고 있어 비특이적 결합을 억제시키기 용이한 11-mercapto-1-undecanol을 혼합한 mixed monolayer 전극을 제작하였다. 그러므로 mixed monolayer 전극은 각 구성요소의 특징에 의해 비특이적 결합이 줄어들고 전기화학적인 면역센싱이 가능한 전극이 제조되었다. 이렇게 제조된 전극은 효소반응을 응용한 면역센서의 전극으로 사용되었다. 효소반응을 이용한 전기화학적 면역센싱을 위해 전기화학적으로 활성을 가지는 glucose oxidase (GOX) 효소를 사용하였다. 이 효소는 그 자체로 신호물질로 사용할 수 있지만 IgG 타입의 항체와의 합성을 통하여 측정 생체물질인 항체와 항원 모두를 측정할 수 있는 신호물질로 사용하였다. 이를 위해 GOX 효소와 IgG 타입의 항체 사이의 합성은 간단한 화학합성법을 이용하여 합성되었다. 합성된 GOX가 표지된 항체는 액체 크로마토그래피법을 이용하여 물질의 분자량 분석을 통하여 합성 유무를 확인하였다. 합성이 검증된 GOX가 표지된 항체는 전기화학적으로 측정이 가능한 농도를 분석하였다. 그 결과 GOX가 표지된 항체는 0.1 ㎍／㎖부터 0.1 ㎎／㎖에서의 농도범위에서 전기화학적으로 측정이 가능한 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 목적 생체물질을 측정하는 시스템에 적용하였다. 처음 목적물질로 anti-DNP 항체를 이용하여 면역센싱을 실행하였다. 이때 이용된 면역센싱법은 전극 표면에 고정화된 항원 DNP와 면역복합체를 형성하기 위해 목적항체와 GOX가 표지된 항체 사이에서 발생하는 경쟁적 면역작용을 이용하였다. 목적항체와 GOX가 표지된 항체 사이의 농도 비율에 따라 전극 표면에 고정화되는 GOX가 표지된 항체의 양을 통해 표지된 GOX의 효소적 전기화학적 신호로 확인하게 된다. 이렇게 확인된 결과는 고정화된 GOX가 표지된 항체에 의한 것으로 목적항체의 간접적인 신호결과를 얻을 수 있게 된다. 두 항체 사이의 경쟁적 면역반응을 통해 얻어진 결과는 목적 항체의 농도가 1 ㎍／㎖에서 0.1 ㎎／㎖ 사이에서 전기화학적으로 검출 가능한 것을 확인하였다. 그 다음으로 진행된 실험은 목적항원인 DNP 항원을 이용하였다. 이 때는 목적항체와 달리 GOX가 표지된 항체와 면역복합체를 형성하기 위해 전극표면에 고정화된 항원 DNP와 반응 용액 중에 있는 목적항원 DNP 사이의 경쟁적 면역작용을 이용하게 된다. 이 측정으로 목적항원 DNP는 대략 200 nM부터 2 mM에서 전기화학적으로 측정이 가능한 것을 확인하였다.
more초록/요약
Target biomolecules, either antigens or antibodies, were detected using competitive immuno-reaction with enzyme-tagged antibody. The enzyme-tagged antibody was prepared through covalent conjugation reaction between antibody and enzyme. The employed enzyme was glucose oxidase (GOX), a promising applicant for electrochemical signaling. By adopting dinitrophenyl (DNP) group as a target molecule, the conjugation reaction of GOX-tagged anti-DNP antibody was conducted and confirmed by liquid chromatography. The detectable concentration range of GOX-tagged anti-DNP antibody was confirmed by using electrochemical signaling method under competitive reaction, ranging from 0.1 ㎍／㎖ to 0.1 ㎎／㎖. The concentration of GOX-tagged anti-DNP antibody was based on the antibody used in the conjugation. Target biomolecules, including DNP antigen and anti-DNP antibody, were detected by using competitive immuno-reaction with the GOX-tagged anti-DNP antibody on the antigen (DNP)-functionalized sensing surface. Sensing interface was prepared by using poly(amidoamine) dendrimer-assisted self-assembled monolayer. From immunosensor measurements under competition reaction format, target antigen and antibody exhibited linear detection ranges, ca. 200 nM∼2 mM, 1 ㎍／㎖∼0.1 ㎎／㎖, respectively.
more목차
1. 서론 = 1
1.1. 랩온어칩 적용을 위한 전기화학적 면역센서 = 1
1.2. 바이오센서 전극 표면 = 3
1.3. 연구목적 = 4
2. 실험의 재료 및 방법 = 5
2.1. 시약 = 5
2.2. Mixed monolayer 제작 = 5
2.3. Mixed monolayer를 이용한 비표지 방법 면역센싱 = 8
2.4. Glucose oxidase (GOX) 와 항체의 합성 = 8
2.4.1. 합성 방법 = 8
2.4.2. 표지된 GOX에 의한 non-specific binding (NSB) 확인 및 감소 = 11
2.4.3. GOX와 항체의 합성 유무 확인 = 11
2.5. 경쟁적 면역반응을 통한 면역센싱 = 12
2.5.1. GOX가 표지된 항체의 농도에 따른 전기화학적 분석 = 12
2.5.2. 경쟁적 면역반응을 이용한 목적항체의 검출 = 12
2.5.3. 경쟁적 면역반응을 이용한 목적항원의 검출 = 13
3. 결과 및 고찰 = 13
3.1 전극 위에 형성된 mixed monolayer 확인 = 13
3.2. Mixed monolayer 전극을 이용한 비표지 항체 검출 = 17
3.3. 전기화학적 방법과 액체 크로마토그래피 법을 이용한 GOX와 항체의 합성확인 = 21
3.4. 표지된 GOX에 의한 non-specific binding 확인 및 감소 = 25
3.5. 경쟁적 면역분석법을 통한 목적 항체와 항원의 검출 = 27
4. 결론 = 33
Ⅲ. Reference = 35
Ⅳ. Abstract = 37
