HeLa cell의 S phase 에 처리한 HGF 에 의해 유도되는 G2 시기 지연현상에 대한 연구
G2 Delay induced by Hepatocyte Growth Factor Treated to HeLa Cells at S Phase
초록/요약
일반적으로 성장인자는 세포주기의 진행에 있어 G0기부터 S기로 이행하는 동안 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다. 하지만, 그 외 다른 시점에서 성장인자가 세포분열주기에 미치는 영향에 대해서 알려진 바는 거의 없다. 우리는 이전 연구과정에서 G2 시기에 처리한 간세포성장인자에 의해서 G2 시기 지연현상이 유도 되는 것을 관찰하였고 이는 염색체 이상을 조절하는 기능과 관련하고 있다는 것을 증명한 바 있다. 이러한 연구 결과와 더불어 우리는 S기에 간세포성장인자를 처리하게 될 경우 세포분열주기에 미치는 영향과 기전에 대해 알아보고자 하였다. 흥미롭게도, HeLa 세포의 S기 동안에 간세포성장인자를 처리하게 될 경우, FACS 분석과 mitotic index를 통해서 세포 주기의 진행을 추적해 본 결과, S기 진행에는 변화가 없었고 G2기에서 지연현상이 나타났다. cyclin A와 cyclin B가 대조군에 비해 한 시간가량 뒤늦게 감소하고, cyclinB/Cdk1과 cyclinA/Cdk2 의 활성 또한 뒤늦게 감소하는 현상들 역시 간세포성장인자에 의한 G2 시기의 지연현상임을 보여준다. 다음으로 간세포성장인자에 의한 G2 시기의 지연현상이 어떤 기전을 통해서 일어나는지 알아보고자 하였다. 먼저, ATM/ATR siRNA 와 ATM/ATR의 억제제인 caffeine을 이용하여 DNA 손상 checkpoint의 관련 여부를 확인하고자 하였으나 G2 지연 현상과의 연관성은 찾을 수 없었고, pChk1, pChk2, γ-H2AX 와 같은 DNA 손상과 관련한 여러 단백물질들의 활성화의 차이 역시 관찰되지 않았다. 이는 S기에 처리한 간세포성장인자에 의해 유도된 G2 지연현상은 DNA 손상과는 관련성이 없음을 보여준다. 또 다른 원인으로써, 잔존하는 간세포성장인자의 영향인지 알아보기 위해 세포를 고농도의 식염수로 세척해 보았지만, 세척 후에도 간세포성장인자에 의한 G2 지연현상이 유지되는 것을 관찰하였다. 뿐만 아니라, 간세포성장인자 처리 전후 중화항체를 처리한 결과에서 G2 지연현상의 정도에 차이가 있음을 관찰하였다. 이로써 잔존하는 간세포성장인자가 G2 지연현상의 원인이 아님을 알 수 있다. 하지만, S phase 에 처리한 간세포성장인자에 의해 활성화되는 신호전달체계를 알아보던 중, MAPK 와 PI3K 신호전달체계가 오랫동안 활성화 되는 것을 관찰하였다, 실제로 이들 신호전달체계가 G2 지연현상에 어떻게 관여하는지 알아보기 위해 MAPK의 억제제인 U0126과 PI3K 의 억제제인 LY294002를 사용하였다. 흥미롭게도 Erk를 통한 MAPK 신호전달체계는 G2 지연현상을 강화하고, 반면 Akt를 통한 PI3K 신호전달체계는 이를 완화하는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 지금까지 결과를 종합해 볼 때, S phase에 처리한 간세포성장인자에 의해서 활성화된 여러 신호전달체계를 중에서, ERK를 통한 MAPK 경로와 Akt를 통한 PI3K 신호전달체계가 이러한 G2 지연현상의 완급을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있다고 결론지을 수 있다.
more초록/요약
Growth factors are well known to play essential roles in the transition from G0 to S phase in the cell cycle progression. However, the effect of growth factors on the cell cycle progression other than G0 to S progression is poorly understood. In our previous study, we observed that the cell cycle progression in G2 phase was delayed when cells at G2 phase were treated by hepatocyte growth factor (HGF) and that demonstrated the G2 delay was related with ensuring the chromosomal stability. Here in, we examined the effect of HGF treatment on HeLa cells at S phase and its underlying mechanisms. The delay of cell cycle progression in G2 phase was detected by both flow cytometric and mitotic index analyses and, the delay corresponded with the delay of degradation of cyclin A and cyclin B and the decrease of Cdk1／cyclinB and Cdk2／cyclinA kinase activities. Neither ATM／ATR siRNA nor caffeine, an ATM／ATR kinase inhibitor, could successfully block the HGF-induced G2 delay, suggesting that the chance of HGF working as a DNA damaging agent to cause G2 delay is low. Furthermore, the fact that the G2 delay remained after washing the HGF-treated cells or after addition of neutralizing anti-HGF antibody also indicates that the residual HGF was not involved in the G2 delay. However, we observed continuous activation of both MAPK and PI3K pathways by HGF treatment. Furthermore, since studies using inhibitors indicated that MAPK pathway enhanced the delay of cell cycle progression in G2 phase through Erk, whereas PI3K pathway weakened it through Akt, both signal pathways appears to be involved in the regulation of cell cycle progression after HGF treatment. Taken together, treatment of HeLa cells at S phase with HGF delays the cell cycle progression in G2 phase, possibly through sustained activation of Erk signaling, which is weakened by the activation of PI3K pathway.
more목차
Ⅰ. Introduction = 6
Ⅱ. Materials and Methods = 8
A. Reagents and antibodies = 8
B. Cell culture and synchronization = 8
C. DNA FACS analysis and Mitotic index = 9
D. Western blot analysis and CDK kinase assay = 9
E. Transfection = 11
F. Treatment of inhibitory reagents = 11
Ⅲ. Results = 12
A. Cell cycle delay induced by HGF treatment at S phase = 12
B. G2 delay induced by HGF treatment at S phase = 14
C. No involvement of DNA damage checkpoint pathway = 17
D. No change in G2 delay either by washing the cells in G2 phase or by using neutralizing anti-HGF antibody = 20
E. Blocking cell cycle progression by cycloheximide = 22
F. Sustained signals induced by HGF treatment at S phase = 24
G. Signals involved in G2 delay induced by HGF treatment at S phase = 27
Ⅳ. Discussion = 31
Ⅴ. Conclusion = 34
Ⅵ. References = 36
국문 요약 = 41
