Streptomyces avermitilis에서 gene knock-out에 의한 oligomycin 생합성 저해
Inhibition of oligomycin biosynthesis by gene knock-out in Streptomyces avermitilis
- 주제(키워드) streptomyces avermitilis , gene disruption , oligomycin , gene knockout , 방선균
- 주제(KDC) 570.62
- 주제(DDC) 660.62
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 유연우
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
방선균은 다양한 생리활성 물질을 이차대사산물로 생산함에 따라 산업적으로 매우 유용한 균주로 여겨진다. 이에 따라 많은 연구진들이 방선균에 대한 분자생물학적 연구와 개발, 산업적 응용에 초점을 맞추고 있다. 방선균 중에서도S. avermitilis 는 강력한 구충효과를 가지는8가지 종류의 avermectin compounds를 생산하는데, 그 중에서도 avermectin B1a가 가장 활성이 좋다. 그러나 S. avermitilis 는 포유동물 세포에서 미토콘드리아의 산화적 인산화 과정을 저해하는 toxic compound인 oligomycin을 함께 생산하기 때문에 순수한 avermectin을 얻기 위해서는 대사산물의 분리, 정제 과정이 수반된다. 이는 S. avermitilis균주를 개량한다 할지라도 동일하게 oligomycin을 생산하게 되므로, 산업적 균주로의 이용에서oligomycin의 생합성 저해를 통한 순수한 avermectin의 생산은 필수적이다. 본 연구에서는 방선균의 분자유전학적 특성을 이해하고, 대사공학의 관점에서 oligomycin 생합성 유전자를 deletion하여 oligomycin의 생합성을 억제하였다. S. avermitilis 로부터 cloning한 oligomycin 생합성 유전자 (olmA5) 의 중앙 부분에 apramycin resistance gene을 끼워넣어 integration vector를 구축한 후, S. avermitilis의 chromosomal DNA와의 gene replacement를 이용하여 유전자의 disruption을 유도하였다. Disruption mutants (olmA5::apra) 의 확인은 PCR을 통해 olmA5 gene의 위치에서apramycin resistance gene을 확인하였고, HPLC 분석을 통해 oligomycin 생합성이 완전히 억제된 것을 확인할 수 있었다. 그리하여 disruption mutant (olmA5::apra) 를 이용하여 avermectin만을 생산할 수 있었으나 avermectin의 생산량에는 변화가 없었다. 이러한 mutants는 산업적으로 단일 avermectin의 생산시 유용하며, 차후의 avermectin생산 증대를 위한 균주 개량의 좋은 source가 될 수 있다. 또한 산업현장에서 작업 근로자들을 유해물질 (oligomycin) 로부터 보호할 뿐 아니라 avermectin의 분리, 정제 과정을 간소화하여 시간과 경제적 절감 효과를 기대할 수 있다.
more초록/요약
Streptomyces is a Gram-positive, aerobic soil bacterium, has growth pattern similar with fungus. Streptomyces is well known for their ability to synthesize an enormous variety of antibiotics as secondary metabolites. Among them, S. avermitilis produces avermectins, a group of antiparasitic agents used in human and veterinary medicine. However, S. avermitilis also produces oligomycin, which is a potential toxic inhibitor of oxidative phosphorylation in mammalian cells. Therfore, we decided that disruption oligomycin synthetase gene to prevent coproduction of oligomycin in S. avermitilis. To create plasmid for disruption, the smallest gene of oligomycin synthetase gene cluster was obtained by PCR from S. avermitilis. chromosome. Then, apramycin resistance gene was inserted in oligomycion synthetase gene for selection. After transformation of this plasmid, oligomycin synthetase gene(olmA5) in the chromosome was displaced with disruption cassette on the plasmid via homologous recombination. As a result of this gene replacement, we obtained mutants(olmA5::apra) that no longer makes the toxic oligomycin. And the mutants confirmed by PCR & HPLC analysis. However, no increasement of avermectin production in the mutant was observed. This mutant (olmA5::apra) can become a good source of strain improvement for better avermectin production. Because use of the mutant can simplify separation of avermectin, it can be resulted in saving time and cost as well as protect worker from hazardous substance (oligomycin) in industrial place.
more목차
Ⅰ. 서론 = 1
1. 연구 배경 = 1
1-1. 방선균 = 1
1-2. Streptomyces avermitilis = 3
2. 연구 개발의 목적 및 중요성 = 4
2-1. Avermectin의 기능과 중요성 = 4
2-2. Oligomycin = 6
2-3. 연구 목적 = 8
Ⅱ. 재료 및 방법 = 9
1. 실험 재료 = 9
1-1. 균주 및 플라스미드 = 9
1-2. 배양 배지 = 11
1-3. 효소, 항생제 및 시약 = 14
2. 실험 방법 = 15
2-1. Chromosomal DNA 의 분리 = 15
2-2. OlmA5 gene 의 cloning = 15
2-3. Apramycin resistance gene cassette 의 PCR = 17
2-4. Plasmid 의 분리 = 19
2-5. Conjugation = 20
2-6. Mutant strain (olmA5::apra) 의 확인을 위한 PCR = 22
2-7. Oligomycin 과 avermetin 의 HPLC 분석 = 24
Ⅲ. 결과 및 고찰 = 26
1. OlmA5 gene 의 cloning = 26
2. Integration vector 의 구축 (pKC-olmA5-apra) = 29
3. S. avermitilis 로의 삽입 플라스미드의 전달 = 31
4. Oligomycin knock-out mutants 의 선별 = 33
5. Oligomycin 과 avermectin 의 분석 = 38
Ⅳ. 결론 = 41
Ⅴ. 참고 문헌 = 42
Abstract = 47
