재조합 대장균으로부터 Coenzyme Q10 을 생산하기 위한 decaprenyl diphosphate synthase 의 유전자 클로닝과 발현
Cloning and expression of decaprenyl diphosphate synthase gene for Coenzyme Q10 production from recombinant E. coli
- 주제(키워드) Coenzyme Q10 , decaprenyl diphosphate synthase , 재조합 대장균 , Cloning , DNA sequencing
- 주제(KDC) 570.62
- 주제(DDC) 660.62
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 유연우
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
Coenzyme Q10 은 원핵세포의 원형질막과 mitochondria 내막에 존재하며 항산화적 활성을 띠는 세포 호흡 간에 전자 전달자로서의 역할을 담당하는 필수 조효소일 뿐만 아니라 활성 산소에 의해 발생하는 DNA와 핵산의 손상을 방지하며 지질 과산화, 단백질 산화와 이로 인한 파생되는 세포 노화 및 손상을 방지하고 세포 내의 ATP 생산에 중요한 인자로 작용하며, 세포 신호 전달에서 산화-환원 반응에 깊이 관여하고 있다. 이와 같은 coenzyme Q10 은 건강 보조제, 화장품 원료, 심혈전증 치료제 등 많은 분야에 적용되고 있으며 계속적인 효능에 대한 연구들이 보고되고 있다. 최근 여러 분야에서 산업적으로 각광을 받기 시작한 coenzyme Q10 을 화학적인 방법이 아닌 친인화적인 방법으로 E. coli 를 이용한 생합성을 통하여 생산하고자 시도해 보았다. Coenzyme Q10 을 생성하는 pathway 에서 decaprenyl diphosphate tail 합성에 결정적인 역할을 하는 dps ( decaprenyl diphosphate synthase ) 를 database search 를 통해 확인하였고, A. tumefaciens ATCC 4452 의 dps gene 을 pQE30 expression vector 를 사용하여 cloning 하였다. Gene cloning 을 통해 dps gene을 vector 내에 삽입하였고, restriction enzyme digestion 과 sequencing 을 통해 확인하였다. Cloning 된 dps gnen 의 E. coli 내에서의 발현은 SDS-PAGE 를 이용하여 증명하였으며 A. tumefaciens ATCC 4452 의 dps gene 의 발현이 E. coli 내에서의 coenzyme Q10 생합성을 유도함은 HPLC 분석을 통하여 검토하였다. 그 결과 E. coli 내에서 recombinant 의 coenzyme Q8 의 양은 줄어들고, coenzyme Q10 생성을 concentration 을 0.87 mg/L, content 를 1.79 mg/g DCW 까지 확인할 수 있었다. 이와 같은 현상은 세포 내의 coenzyme Q 의 양을 일정 정도만 유지하는 것으로 보이며 ATP 생성에 필요한 coenzyme Q 는 생체 내에서 최소로 필요한 양만 생성하는 것으로 사료된다. 반복된 실험 결과에도 coenzyme Q 의 양은 항상 일정한 content 를 유지하였다. 아울러 E. coli 내에서의 coenzyme Q8 생산에 필수적인 ops ( octaprenyl diphosphate synthase ) 을 knock-out 시키고, dps 를 genetic recombination 으로 ops 위치에 integration 하였을 때의 coenzyme Q8, coenzyme Q10 의 생산량의 변화와 knock-out 을 통한 gene distruption 의 영향을 관찰하는 것도 coenzyme Q10 의 생산 정도를 이해하는 데에 도움이 될 것으로 생각된다.
more초록/요약
Ubiquinone ( Coenzyme Q ), which is composed of a benzoquinone group and a side chain of varying length of isoprenoid group, is an essential component of the electron transfer system in the plasma membrane of prokaryotes and inner mitochondrial membrane of eukaryotes. Coenzyme Q10 is vital for the proper transfer of electrons within the mitochondrial oxidative respiratory chain, whose main function is adenosine triphosphate production. Additional important physiological function of ubiquinone is an antioxidant activity to prevent DNA damage, lipid peroxidation, protein oxidation. To produce coenzyme Q10, useful to human, dps ( decaprenyl diphosphate synthase ) gene is an essential enzyme, which combines ten isoprenoid diphosphate as coenzyme Q10 tail. Usually, E. coli uses coenzyme Q8 to transfer the electron in the plasma membrane of prokaryotes, nevertheless this pathway is efficient to manipulation, and to acquire electron carrier enzyme. In this study, we have introduced pQE30 harboring dps gene to E. coli to construct coenzyme Q10 production system. The dps gene of Agrobacterium tumefaciens ATCC 4452 was cloned into pQE30 expression vector. The pQE30_dps containing dps gene and promoter region was transformed in E. coli XL-1 blue by electroporation. The recombinant colony was cultured LB broth with Ampicillin, then induced of 1 mM of IPTG for functional expression. In recombinant E. coli, an expression of the dps gene was confirmed by SDS-PAGE and the coenzyme Q10 production with dps gene expression was also confirmed by HPLC analysis ( concentration : 0.8662 mg/L, content : 1.786l mg/g ). This results represents that expression of dps gene from Agrobacterium in E. coli was lead to production of coenzyme Q10.
more목차
1. 서론 = 1
1.1 연구 배경 = 1
1.2 Coenzyme Q10 = 2
1.3 Coenzyme Q10 생합성 = 4
1.3.1 Head group 의 합성 = 4
1.3.1.1 전구체 합성 = 4
1.3.1.2 Escherichia coli 에서 ubiC gene 의 역할 = 4
1.3.2 Tail group 의 합성 = 6
1.3.2.1 Isoprenoid diphosphate 전구체 생산 = 6
1.3.2.2 Polyprenyl diphosphate tail 의 합성과 길이 결정 = 6
1.3.3 4-HB 와 polyprenyl tail 과의 결합 = 7
1.3.4 Ring modification 과정 = 9
1.3.5 dps ( decaprenyl diphosphate synthase ) 와 ops ( octaprenyl diphosphate synthase ) 의 역할 = 9
1.4 Coenzyme Q10 의 생체 내에서의 역활 = 11
1.5 Coenzyme Q10 의 생산 방법 = 12
1.5.1 화학적 합성 = 12
1.5.2 생화학적 합성 = 12
1.6 Coenzyme Q10 의 가치 및 효용 = 14
1.7 연구 목적 = 15
2. 실험재료 및 방법 = 16
2.1 실험재료 = 16
2.1.1 사용균주 및 plasmids = 16
2.1.2 배지 및 배양조건 = 16
2.1.3 시약 = 16
2.2 실험방법 = 18
2.2.1 Chromosomal DNA 순수 분리 = 18
2.2.2 Dps gene 증폭을 위한 PCR = 19
2.2.3 PCR 조건 = 20
2.2.4 PCR product purification = 21
2.2.5 Plasmid DNA 순수 분리 = 21
2.2.6 Electroporation 용 competent cell 제조 = 22
2.2.7 Transformation = 23
2.2.8 DNA의 전기영동 = 24
2.2.9 Restriction enzyme 처리 = 24
2.2.10 Ligation = 25
2.2.11 Recombinant plasmid 확인 = 25
2.2.12 sequencing = 25
2.2.13 Recombinant expression = 26
2.2.14 HPLC analysis = 26
2.2.14.1 Cell extract = 26
2.2.14.2 HPLC 분석 방법 = 27
3. 결과 및 고찰 = 28
3.1 Chromosomal DNA 순수 분리 = 28
3.2 PCR 을 통한 dps gene 의 증폭 = 30
3.3 Recombinant vector construction = 31
3.4 DNA sequencing 을 통한 dps gene cloning 확인 = 33
3.5 Expression of dps gene = 34
3.6 HPLC analysis = 37
4. 결론 = 40
5. 참고 문헌 = 41
Abstract = 46
