세포 사멸 과정 중 감마-시크리테아제 활성화 기전에 관한 연구
Study on the mechanism of
- 주제(키워드) 알츠하이머 질환 , 세포자멸 (Apoptosis) , 감마-시크리테아제 , caspase-3 , Bcl-2 , 활성산소종 (Reactive Oxygen Species; ROS) , Phospholipase A2 (PLA2)
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 정민환
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 한국어
초록/요약
알츠하이머 병 (Alzheimer’s disease; AD)은 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein; APP)로부터 생성되는 베타 아밀로이드(β amyloid; Aβ)라는 펩타이드에 의해 뇌세포의 사멸이 일어남으로써 야기되는 질병으로 알려져 있다. 이제까지 많은 연구자들에 의해 Aβ가 다양한 기전을 통해 배양된 세포의 사멸을 유도한다는 보고가 있어 왔고, 실제 AD에 있어서 세포의 사멸과 Aβ에 의한 발병 사이의 밀접한 관계를 보여주는 많은 증거들이 제시되고 있다. 그러나, 반대로 세포 사멸과정이 어떻게 APP 단백질의 대사에 영향을 미치는 가에 대한 연구는 미미한 실정이다. 본 연구에서는 DNA 손상 유발 물질 (DNA damage-inducing agents; DDIAs)을 처리함으로써 세포의 사멸을 유도했을 때, Aβ 생성을 일으키는 효소 중 하나인 감마-시크리테아제의 활성이 크게 증가하고 이에 따라 Aβ의 생성이 증가함을 확인하였다. 이러한 감마-시크리테아제 활성의 증가는 세포 사멸에 관계된 단백질 중 Bax/Bcl-2에 의존적이며 caspase에는 비의존적으로 일어났고, 이 때 감마-시크리테아제를 구성하는 단백질의 양은 변화하지 않았다. DDIA에 의한 세포 사멸 시에 Bax가 미토콘드리아로 이동하게 되면 cytochrome c가 미토콘드리아 외부로 방출되면서 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS)이 생성되는데, 이것을 항산화제로 제거하거나 전자전달계 효소에 대한 억제제를 처리하면 DDIA에 의한 감마-시크리테아제의 활성 증가가 억제되어 세포 사멸 시에 일어나는 감마-시크리테아제의 활성 증가가 미토콘드리아의 전자전달계에서 생성되는 활성산소종에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한 세포 사멸 시에 활성화되는 것으로 최근 알려진 PKCδ/STAT1 경로에 대한 억제제 처리도 DDIA에 의한 감마-시크리테아제의 활성화를 효과적으로 감소시켜 감마-시크리테아제의 활성화에 PKCδ/STAT1 경로가 관여함을 보여주었다. 이상의 결과는 세포의 사멸이 일어나는 과정에서 Bax 이동에 따른 ROS의 증가와 PKCδ/STAT1 경로의 활성화를 통해 감마-시크리테아제가 활성화되어 Aβ의 생성을 증가시키고, 분비가 증가된 Aβ는 주변의 세포에 대해 또 다른 사멸 신호로 작용하여 세포 사멸과 Aβ 생성간에 양성 되먹임 고리(positive feedback loop)가 형성됨으로써 알츠하이머 병 환자에서 나타나는 대량의 세포 사멸로 이어질 수 있음을 의미한다. 본 연구에서는 이러한 양성 되먹임 고리를 산발성 AD의 발생 기전에 대한 새로운 모델로 제시하고자 하며, 이에 관여하는 것으로 제시된 기전은 AD의 발생을 예방하거나 진행을 억제하기 위한 약물 개발의 새로운 표적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
more목차
차례
국문요약--------------------------------------------------iv
차 례---------------------------------------------------vi
본문차례--------------------------------------------------vi
그림차례--------------------------------------------------x
약 어---------------------------------------------------xii
본문차례
I. 서론-----------------------------------------------------1
1. Amyloid precursor protein (APP) 대사과정-----------------2
가. Amyloidogenic pathway -------------------------------3
나. Non-amyloidogenic pathway---------------------------5
2. 시크리테아제(secretase)---------------------------------5
가. α-secretase---------------------------------------------6
나. β-secretase---------------------------------------------7
다. γ-secretase-------------------------------------------8
3. Apoptosis ----------------------------------------------11
가. Apoptosis의 주요인자----------------------------------11
나. Apoptosis 신호전달과정--------------------------------14
다. 산화 스트레스와의 연관성-------------------------------15
라. PKCδ/STAT1 경로 와의 연관성-------------------------18
마. PLA2와의 연관성--------------------------------------19
4. Apoptosis와 APP 대사의 연관성 --------------------------21
가. Apoptosis에 의한 APP 대사 변화------------------------21
나. 산화스트레스에 의한 APP 대사 변화---------------------22
II. 실험방법 및 재료------------------------------------------25
1. 세포주 배양 및 시약처리 ----------------------------------25
2. 시약 ----------------------------------------------------27
3. Luciferase assay-----------------------------------------28
4. In vitro peptide cleavage assay ---------------------------28
5. Western blotting-----------------------------------------29
6. DNA fragmentation --------------------------------------30
7. Caspase-3 activity assay--------------------------------30
8. Transfection --------------------------------------------31
9. RNA interference----------------------------------------31
10. Sandwich ELISA----------------------------------------31
11. ROS 검출----------------------------------------------32
12. MTT assay--------------------------------------------32
13. 통계처리-----------------------------------------------33
III. 실험결과------------------------------------------------34
제 1 장. 세포사멸 유도에 의한 γ-secretase 활성 증가-----------34
1. Apoptosis에 의한 Aβ 생성 증가-----------------------------34
2. Apoptosis에 의한 γ-secretase 활성 증가--------------------36
가. DDIA에 의한 γ-secretase의 활성 증가----------------------36
나. staurosporine에 의한 γ-secretase의 활성 증가-------------39
다. DDIA에 의해 증가된 γ-secretase 활성의 기질 특이성--------42
3. Apoptosis에 의한 β-secretase 활성 변화--------------------44
4. Apoptosis에 의한 γ-secretase 활성화 기전------------------44
가. Apoptosis 중 γ-secretase 구성 단백질의 변화--------------44
나. DDIA에 의해 증가된 γ-secretase 활성의 조절---------------47
제 2 장. ROS에 의한 γ-secretase 활성화----------------------55
1. Apoptosis에 의한 ROS의 증가-----------------------------55
2. DDIA에 의해 증가된 ROS에 의한 γ-secretase의 활성 조절----55
가. 항산화제에 의한 γ-secretase 활성 조절--------------------55
나. γ-secretase의 활성 조절에 관여하는 ROS의 종류-----------57
다. γ-secretase의 활성 조절에 관여하는 ROS의 생성장소 -------60
3. 산화 스트레스에 의한 γ-secretase의 활성 조절 --------------62
제 3 장. PKCδ/STAT1 경로 및 PLA2에 의한 γ-secretase 활성화-65
1. DDIA에 의한 PKCδ/STAT1 경로의 활성화-------------------65
2. γ-secretase 활성화에 대한 PKCδ 활성 억제의 효과-----------65
3. γ-secretase 활성화에 대한 STAT1 활성 억제의 효과---------68
4. γ-secretase 활성화에 대한 PLA2 활성 억제의 효과-----------71
IV. 고찰----------------------------------------------------74
제 1 장. 세포사멸 유도에 의한 γ-secretase 활성 증가-----------74
제 2 장. ROS에 의한 γ-secretase 활성화----------------------77
제 3 장. PKCδ/STAT1 경로 및 PLA2에 의한 γ-secretase 활성화-78
V. 참고문헌-------------------------------------------------81
영문요약---------------------------------------------------103
