알파시누클린 단백질이 박테리아 유래의 에스터라제 활성 안정성에 미치는 영향
Effect of α-Synuclein Protein on the stability of Bacterial Esterase Activity
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 유연우
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
α-Synuclein은 원래 신경세포에서 발견되는 단백질로써 높은 온도에서도 안정하다. 이 특성을 이용하여 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304, Psedomonas fluorescens KCTC 1767, P. fluorescens KCTC 1767의 mutant인 6-52과 metagenome 중에서도 갯벌에서 분리한 KYJ25 유래의 esterase를 사용하였으며, α-synuclein의 첨가에 따른 열안정성과 용매 안정성에 대한 esterase 활성에 미치는 영향을 검토하였다. Esterase를 실험에 사용하기 위해 E.coli cell을 배양하여 sonicator를 사용하여 cell을 깨고, cell extract는 pQE30 expression vector에 있는 6X histidine tag을 Ni-NTA resin을 이용하여 순수분리 하였으며, α-synuclein은 E.coli cell을 배양하여 sonicator를 사용하여 cell을 깨고, Gel filtration chromatography는 Superdex -200 filtration column으로 순수 분리하여 사용하였다. Esterase에 α-synuclein을 첨가했을 때, esterase의 thermostability가 증가하는 지를 실험하기 위해서, 순수 분리한 esterase에 α-synuclein을 1:2, 1:4, 1:5, 1:10 첨가하여, 각각 상온, 40℃, 50℃, 60℃ 또는 상온, 70℃, 80℃, 90℃에서 1시간 동안 전처리 하여, ρ-Nitrophenol계 기질을 사용하여 효소의 활성을 조사하였다. 그 결과 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 유래의 esterase AF, Psedomonas fluorescens KCTC 1767의 mutant인 6-52유래의 esterase 6-52, KYJ25 유래의 esterase KYJ25의 경우, α-synuclein을 첨가하는 비율의 증가에 따라서, esterase의 thermostability가 증가한다. 하지만 Psedomonas fluorescens KCTC 1767 유래의 esterase KCTC1767의 경우는 변화하지 않았다. Solvent stability에는 총 6가지의 유기용매를 사용하였다. Methanol, Ethanol, Isopropyl-alcohol, butanol, acetone, acetonitrile을 각각 5%와 10%로 나누어 첨가하였다. Esterase와 α-synuclein는 각각의 esterase 종류에 따라서 최적의 농도비로 섞어서 solvent stability를 확인하였다. α-synuclein을 첨가하지 않았을 때로 100%하여 relative activity를 구하였다. α-synuclein이 첨가하였을 때, 대체적으로 안정성이 증가하였으며, methanol의 경우에는 최고 80%까지의 활성이 유지되었다. α-Synuclein을 첨가하였을 때, 여러 가지 pH조건에서 ketoprofen 분해능의 변화를 보았다. α-synuclein과 α-synuclein의 mutant인 112를 첨가하였을 때 esterase AF, esterase KYJ25에서 ketoprofen 분해능이 증가하였다. Esterase KCTC1767, esterase 6-52의 경우에는 산성과, 알칼리성 조건에서 α-synuclein을 첨가하였을 때, 분해능이 증가하였다. 세포내에서 α-synuclein과 esterase를 동시에 발현하였을 때에도 시험관내에서와 마찬가지로 stability가 증가되는지를 확인하기위해서 열안정성이 없는 esterase KCTC1767과 esterase 6-52, esterase KYJ25를 각각 α-synuclein wild type과 mutant 112를 동시에 발현시켰다. 활성이 남아있는지를 확인하기 위한 기질로는 α-Naphtylacetate와 Fast blue B salt를 사용하였으며, 열전처리는 70℃에서 1시간의 조건에서 수행하였다. α-synuclein을 동시에 발현시켰을 때 esterase만 발현시킨 control에 비해서, 활성이 더 많이 나타났거나, 혹은 동시에 발현시킨 것에서만 활성이 나타났다. α-Synuclein과 esterase의 반응시 morphology를 관찰하기 위해서 AFM(atomic force microscopy)로 측정하였다. AFM 측정시 α-synuclein과 esterase는 30 ㎚ 의 높이에서 관찰이 가능하나 α-synuclein과 esterase KYJ25를 반응시킨 후에 AFM 관찰시, Tip 100 ㎚의 높이에서 볼 수 있을 정도의 크기였으며, monomer 형태가 아닌, 십자가로 모여 있음을 확인하였다. α-synuclein이 esterase의 stability에 영향을 주는 이유로 두개의 단백질이 어떠한 interaction이 일어날 것으로 예상된다. 따라서, α-synuclein을 esterase에 최적의 비율로 첨가하였을 때 온도안정성, 유기용매 안정성, ketoprofen 분해능을 증가시키며, 시험관내에서 뿐만 아니라 세포내에서도 온도안정성이 증가했으며, 용매 안정성 또한 증가할 것으로 예상된다. α-Synuclein의 첨가 후, 안정성이 증가하는 것은 α-synuclein과 esterase의 어떤 interaction에 의한 것으로 예상한다.
more목차
List of tables ⅲ
List of figures ⅳ
국문요약 ⅵ
제 1장 서 론 1
1.1 연구배경 1
1.2 Esterase 5
1.3 2-Arylpropionic acids계 소염진통제의 효소적 광학분할 10
1.4 열충격 단백질의 특징 11
1.5 α-Synuclein 14
1.6 연구목적 17
제 2장 실험재료 및 방법 18
2.1 실험재료 18
2.1.1 사용균주 및 plasmids 18
2.1.2 사용된 단백질 18
2.1.3 배지 및 배양조건 22
2.1.4 시약 22
2.1.5 Ketoprofen ethyl ester의 합성 22
2.2 실험방법 24
2.2.1 Plasmid DNA의 분리 24
2.2.2 Electroporation 용 competent cell 제조 24
2.2.3 DNA 전기영동 25
2.3.4 Transformation 26
2.2.5 Esterase의 정제 26
2.2.6 α-Synuclein의 발현 및 정제 28
2.3 분석방법 30
2.3.1 단백질 정량 30
2.3.2 단백질 전기영동 30
2.3.3 Esterase의 활성 측정 31
2.3.4 효소의 온도안정성 측정 32
2.3.5 효소의 유기용매 안정성 측정 32
2.3.6 다양한 pH조건에서의 ketoprofen 분해능 측정 33
2.3.7 α-Synuclein과 esterase의 동시발현 33
2.3.8 AFM 측정 34
제 3 장 결과 및 고찰 35
3.1 Esterase의 정제 35
3.2 α-Synuclein의 정제 37
3.3 α-Synuclein 첨가에 따른 thermostability 42
3.4 α-Synuclein 첨가에 따른 solvent stability 47
3.5 다양한 pH조건에서 esterase활성 59
3.6 세포내에서 α-synuclein과 esterase의 동시발현 65
3.7 AFM 측정 67
제 4 장 결론 70
제 5장 참 고 문 헌 72
Abstract 80
