Saccharomyces cerevisiae로부터 S-Adenosylmethionine synthetase 유전자의 클로닝과 특성연구
Cloning and characterization of the S-Adenosylmethionine synthetase gene from Saccharomyces cerevisiae
- 주제(키워드) S-Adenosylmethionine synthetase
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 유연우
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
S-Adenosylmethionine(SAM)은 생체내에서 methllyl group 공여체 또는 생장에 관련된 물질의 전구체로서 다양한 기늘을 갖는 필수 물질이다. 이러한 SAM은 SAM synthetase에 의하여 ATP와 L-methionine으로부터 합성된다. Saccharomyces cereviae의 SAM synthetase gene을 cloning하기 위하여 이미 알려진 유전자 염기서열을 바탕으로 primer를 제작하여 PCR을 통하여 증폭시켰다. 증폭시킨 SAM synthetase gene은 E. coli XL1-Blue를 숙주로하여 pQE30에 cloning하였고 염기서열을 결정하였다. 유전자의 염기서열 분석 결과 보고된 S .cerevisiae와는 99%가 일치하였으며, 다른 gene의 효소 및 곰팡이와는 80% 정도의 상동성을 나타내었다. 또한 염기서열에 의해서 아미노산 서열의 추정결과에서 총 384개의 아미노산으로 이루어진 약 41kDa의 분자량을 가진 효소로서 기질인 ATP 및 merhionine과 metal ion(Mg2+)의 binding site가 잘 보존되어 있음을 확인 하였다. 그러나 이 유전자는 E .coli에서 발현시켜 분리 한 후에 효소활성을 측정하였다. 효소 활성은 나타나지 못하였다. 따라서 숙주세포를 E. coli 대신 효소인 Pichia pastoris에서 발현시켜 효소활성을 측정할 예정이다.
more목차
목 차............................................................................ⅰ
List of Table..................................................................ⅱ
List of figuers...............................................................ⅲ
Ⅰ. 서론..........................................................................1
1.1 효모........................................................................1
1.2 SAM이란.................................................................9
1.3 연구목적................................................................11
Ⅱ. 실험 재료 및 방법......................................................12
Ⅱ-1 실험재료...............................................................12
Ⅱ-1-1 사용 시약 및 효소..............................................12
Ⅱ-1-2 사용 균주와 plasmid..........................................12
Ⅱ-1-3 사용 배지 및 균주 성장 조건................................13
Ⅱ-2 실험방법...............................................................20
Ⅱ-2-1 대장균에서의 DNA분리와 재조합..........................20
Ⅱ-2-1-1 Chromosomal DNA 분리.................................20
Ⅱ-2-1-2 Low stringency PCR......................................21
Ⅱ-2-1-3 Plasmid 분리.................................................22
Ⅱ-2-1-4 전기영동.......................................................22
Ⅱ-2-1-5 SAM-s gene selection...................................22
Ⅱ-2-1-6 Restriction enzyme........................................22
Ⅱ-2-1-7 Ligation........................................................23
Ⅱ-2-1-8 재조합 SAM-s의 정제.....................................24
Ⅱ-2-1-9 단백질 정량...................................................24
Ⅱ-2-1-10 단백질 전기영동............................................24
Ⅱ-2-1-11 염기서열 분석...............................................24
Ⅱ-2-2 형질전환.............................................................25
Ⅱ-2-2-1 대장균의 Competent cell제조와 형질 전환..........25
Ⅱ-2-2-1-1 E. coli electroporation용 competent cell의 제조................................................................................25
Ⅱ-2-2-1-2 Transformation.............................................25
Ⅱ-2-2-2 효모의 Spheroplast와 electroporation용 competent cell 제조와 형질전환.......................................................26
Ⅱ-2-2-2-1 Yeast Electroporation competent cell의 제조................................................................................26
Ⅱ-2-2-2-1 Spheroplast제조.........................................26
Ⅱ-2-2-2-3 Integration transformation.............................27
Ⅱ-2-3 효모에서의 DNA분리와 재조합................................27
Ⅱ-2-3-1 Pichia vector로의 cloning................................27
Ⅱ-2-3-2 Mut+와 Muts transformants의 선별...................29
Ⅱ-2-3-3 Pichia로부터 total DNA 분리............................29
Ⅱ-2-3-4 Pichia 형질전환체의 PCR 분석.........................30
Ⅲ. 결과 및 고찰.............................................................31
Ⅲ-1 S. cerevisiae로부터 SAM synthese........................31
Ⅲ-2 재조합 S. cerevisiae의 sequence 분석....................35
Ⅲ-3 재조합 SAM synthetase의 정제..............................38
Ⅲ-4 Yeast system에서 SAM synthetase의 cloning.........41
Ⅲ-5 Pichia pastoris에서 integration과 recombination.......44
Ⅲ-6 효모에서의 형질전환.............................................45
Ⅲ-7 Mut+와 Muts 형질전환체의 선별.............................47
Ⅲ-8 Pichia 형질전환체의 PCR분석................................48
Ⅳ. 결론....................................................................49
Ⅴ. 참고문헌..............................................................50
