스핑고신키나제와 세라마이드키나제 억제제 탐색 및 약리작용 연구
Screening of Sphingosine kinase and Ceramide kinase inhibitors and pharmacological characterization
- 주제(키워드) Sphingosine kinase inhibitor , Ceramide kinase inhibitor
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 유연우
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
국문 요약 생체막에 존재하는 스핑고지질(Sphingolipid)은 인지질(Phospholipid)과 함께 세포막 (Membrane)을 구성하는 주요 물질로서, 세포의 성장, 분화, 사멸 등의 생명 현상을 조절하는 물질이다. 이러한 과정은 세포가 외부 자극을 받아 생체막의 스핑고미엘린(Sphingomyelin; SM)이 분해되어 진행되는데, 스핑고미엘린의 분해물인 세라마이드(Ceramide;CER), 스핑고신 (Sphingosine;SPH), 스핑고신 일 인산(Sphingosine 1-phosphate;S1P)은 세포 내 2차 신호 전달자 (Second messenger)로서 작용한다. 본 연구에서는 Pichia ciferrii 효모를 이용한 발효를 통해 얻은 phytosphingosine(PHS)을 유도체 합성의 기초물질로 사용하였으며 N-alkylation, O-alkylation, intramolecular cyclization, Pegylation을 통하여 스핑고지질 유도체를 합성하였다. 또한 Chiral Aziridine-2-Carboxylates를 시작 물질로 이용하고, alkylation반응을 통한 aziridine ring opening, dehydrogenation을 통한 debenzylation, acylation반응을 거쳐 스핑고지질 유사체를 제조하였고, 이 물질들을 이용하여 스핑고신키나제와 세라마이드키나제의 저해 효과를 탐색하였다. 스핑고신키나제(Sphingosine kinase : SPHK)는 SPH를 인산화시켜 S1P로 전환시키는 효소로서 최근 발암 유전자로서의 가능성이 제기되어 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 기존의 스핑고신키나제 억제제인 디메칠스핑고신(N,N-dimethylsphingosine:DMS)보다 스핑고신 키나제 억제효과가 우수한 수개의 화합물을 발견하였다. 모노메칠파이토스핑고신(N’-monomethylphytosphingosine;MMPS)을 이용한 실험을 통해 모노메칠파이토스핑고신이 세포 내 SPHK활성을 억제하여 SPH 및 CER를 축적시키는 것을 확인하였고, 여러 암 세포에서 세포사멸을 유도하는 것을 확인 하였다. 특히 항암 치료의 효과를 증가시키기 위하여 방사선 조사와 함께 사용한 실험에서 Synergy효과가 우수하여 방사선 치료의 효과를 증가시켰으며 이는 MMPS가 방사선 민감제 (sensitizer)로서 활용될 수 있는 가능성을 확인하였다. 한편 아지리딘링(Aziridine ring)을 이용하여 합성한 스핑고신 유사체 중 SPHK 2에 대해 특이적인 억제효과를 가지는 SG12와 SG14를 얻었다. 기존의 SPHK저해제인 DMS는 SPHK의 subtype에 대한 선택성이 없고, 프로테인 키나제 C(Protein kinase C; PKC)도 억제하는 단점이 있었으나, SG14는 SPHK1과 PKC는 저해하지 않고, SPHK2만 억제하였다. 면역억제제로서 개발되고 있는 스핑고지질 유사체인 FTY-720이 세포 내에서 SPHK 2에 의해 인산화되어 활성화 되는 것이 확인되면서, SPHK2의 역할이 강조되고 있으며, 본 연구에서 개발된 SG14은 immune modulator의 활성화 조절에 활용될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 세라마이드 1 인산(C1P)은 CERK에 의해 CER가 인산화되어 생성되며, 세포 사멸의 억제 및 면역세포에서 탈 과립화에 관여하는 것이 알려졌다. 본 연구에서 사용한 유도체 중 CERK활성을 저해하는 효과가 우수한 물질을 얻었다. CERK 저해제인 K1은 SPHK나 디아실글리세롤키나제(DGK)에 영향을 미치지 않고 CERK만을 억제하였다. K1이 면역세포인 mast cell의 탈과립(degranulation)화를 억제하는 것으로 보아 CERK 와 C1P가 알러지(Allergy) 반응에 관여함을 확인하였으며, CERK 저해제가 과민 면역반응의 억제에 활용될 수 있음을 제시하였다.
more목차
Contents
국문요약 9
General introduction 11
1)스핑고지질 11
2)스핑고지질과 생체막 11
3)스핑고지질의 구조 13
4)스핑고지질의 생합성 15
5)세라마이드의 신호 전달과 세포 사멸 18
6)Sphingosine 1-phosphate (S1P) 20
7)스핑고지질과 암 25
8)스핑고지질과 면역 28
9)Reference 31
스핑고신키나제 억제제 탐색 및 항암 활성연구
Summary 42
Introduction 43
Materials and Method 46
1) Compound used for Sphingosine kinase inhibitor screening 46
2) DNA construction 51
3) Cell culture and DNA transfection 51
4) Immunoblotting 52
5) In vitro Sphingosine kinase assay 52
6) Cytotoxicity assay 53
7) In vitro Protein Kinase C(PKC) assay 54
8) Platelet preparation 54
9) Metabolism of [3H] sphingosine in platelets 55
10) Quantification of Sphingosine and sphingosine 1- phosphate using HPLC 55
11) Animals and tumor model 56
12) DNA fragmentation 56
13) In vivo MMPS treatment and assessment of tumor response 57
14) Change of Mitochondrial membrane potential 57
15) Flow cytometric analysis 57
Results 59
1) Expression of hSPHK 1 and hSPHK 2 59
2) Inhibitory effect of sphingoid analogs on in vitro SPHK activity 59
3) Cytotoxic effects of hSPHK2-specific inhibitor in CHO-K1 cells 68
4) Inhibiton of In vitro Protein Kinase C activity by SPHK2 inhibitors 70
5) Inhibition of the phosphorylation [3H] SPH into [3H] S1P in platelets 72
6) Inhibitory effects of SG14 on SPHK2 activity towards various substrate 74
7) Cytotoxic effects of MMPS on various cancer cell 76
8) Change of sphingolipid rheostat by treatment of MMPS in HL60 80
9) Tumor growth inhibition assay 82
10) Apoptotic cell death by MMPS treatment 85
Discussion 91
Reference 94
세라마이드키나제 억제제 탐색 및 면역세포 탈과립화에 미치는 영향연구
Summary 99
Introduction 100
Materials and Method 102
1)Compounds used in Ceramide kinase inhibitor 102
2)Materials 103
3)Plasmid construction and Cell culture 103
4)In vitro Cermide kinase assay 103
5)Endogeneus C1P formation assay (Metabolic labeling of Cells) 104
6)Degranuation assay 104
7)Western blot analysis of tyrosine phosphorylation 105
8)Intracellular Ca2+ measurement 106
Results 107
1) Synthesis of F-12509A analogs 107
2) K1 inhibits CERK activity in vitro 109
3) K1 is membrane permeable and an effective CERK inhibitor in intact cells. 109
4) K1 has no cytotoxic effect against RBL-2H3 cells 112
5) Suppression of mast cell degranulation by K1. 112
6) K1 leaves IgE/antigen induced global tyrosine phosphorylation and Ca2+ elevation intact. 115
Discussion 117
Reference 119
Abstract 122
