Streptomyces avermitilis의 에스-아데노실메티오닌 합성효소 특성과 폴리케티드 항생제 생성에 미치는 영향
Characterization of S-Adenosylmethionine Synthetase from Streptomyces avermitilis and Effect of S-Adenosylmethionine on the Production of Polyketide Antibiotics
- 발행기관 아주대학교
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
Streptomyces avermitilis NRRL8165로 부터 모든 생명체의 methyl group donor인 S-adenosylmethionine (SAM)을 생합성하는 S-adenosylmethionine synthetase (SAM-s)의 gene을 클로닝하여, 유전자에 대한 분석과 발현 단백질의 효소적 특성에 대하여 조사하였다. 분리된 전체 SAM-s gene은 1,454 bp 이었으며, 이 유전자의 245 bp에 start codon인 GTG을 시작으로 1,209 bp의 open reading frame (ORF)을 가진 것으로 확인 되었다. SAM-s gene의 유전자 서열을 분석한 결과 68.7%의 높은 G+C의 비율을 나타내었으며, start codon의 upstream으로 -3 bp에 purine-rich ribosomal binding site (RBS)와 –35, –10 consensus promoter sequences가 있는 것을 확인하였다. S. avermitilis NRRL5776의 ORF SAM-s 유전자는 402 개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 이미 밝혀진 다른 Streptomyces 종의 SAM-s 아미노산 서열과 비교 분석한 결과 매우 높은 아미노산 서열의 상동성 (84-93%)을 보였으며, ATP binding site로 알려진 P-loop의 nonapeptide 276GGGAFSGKD 284 와 metal binding site (Mg2+: 17D 와 289D 그리고 K+: 49G)와 일치된 서열을 갖고 있음을 확인하였다. 또한, S. avermitilis NRRL8165에서 분리한 ORF SAM-s gene을 Escherichia coli에서 형질 전환시켜 발현시킨 S-adenosylmethionine (SAM) synthetase의 분자량은 약 43.5 kDa 이었다. 분리된 효소를 in vitro에서 ATP와 L-methionine을 기질로 효소반응을 유도시켜 반응산물인 SAM을 HPLC, TLC로 확인하였다. SAM-s의 enzyme kinetic parameter에서 ATP에 대해서는 340(±18) μM의 Km과 21.6(±1.5) μmol/mg/min의 Vmax, 0.22 s-1의 Kcat 값을 나타내었으며, L-methionine에 대해서는 110(±32) μM의 Km과 7.9(±0.2) μmol/mg/min의 Vmax, 0.14 s-1의 Kcat 값을 나타내었다. 따라서 분리된 SAM-s 유전자가 SAM-s 단백질을 암호화하고 있음을 증명하며, 또한 Streptomyces 에서 처음으로 SAM-s 단백질의 enzymatic kinetics 특성을 밝혀내었다. SAM-s 단백질에 대한 효소적 활성은 pH 8.0과 35oC에서 최대의 활성을 보였으며, 다른 동(미)생물과 마찬가지로 Mg2+ 또는 Mn2+와 같은 이가 양이온을 cofactor로써 필요함을 밝혀내었다. Avermectin 및 oligomycin을 생산하는 S. avermitilis와 doxorubicin을 생산하는 S. peucetius 배양액에 SAM을 첨가하여 항생제 생성에 대한 영향을 알아본 결과 avermectin B1a의 경우, 1000 μM SAM 농도에서 SAM을 첨가하지 않은 것보다 약 4.1배 정도 생성이 증가하였으며, Oligomycin A, C에 있어서 100 μM SAM 농도에서 SAM을 첨가하지 않은 것보다 각각 약 3.2배, 2,1배 생성이 증가하였다. Doxorubicin의 경우, 500 μM SAM 농도에서 SAM을 첨가하지 않은 것 보다 약 4배 정도의 생성이 증가하였다. S. avermitilis와 S. peucetius에 SAM-s을 과대발현 시킨 결과 dry cell weight 기준으로 twild type과 비교해서 avermectin는 약 2.2배, oligomycin A, C는 각각 1.9배, 1.7배로 생성이 높아 졌으며, sporulation도 억제를 하였다. 또한 doxorubicin는 약 3.5배의 생산성 향상을 보였다. 그러므로 SAM은 세포의 형태학적 변화에 대해서 뿐만 아니라 methyl가 요구되어지는 polyketide계 항생물질에 대해서 생산성을 증가시킬 수 있는 다형질의 물질임을 보여 주였다
more목차
List of Tables i
List of Figures ii
Abbreviation v
국문요약 vi
Ⅰ. 서 론 1
1. 배 경 1
2. 방선균 2
2.1. 방선균의 정의 2
2.2. 항생물질 3
2.3. 이차대사산물인 polyketide 화합물 5
2.4. Polyketide 계 항생물질과 배지조성 7
3. 이차대사산물생산과 분화에 대한 조절인자 8
3.1. Signaling molecules에 의한 조절 8
3.2. S-Adenosylmethionine (SAM)에 의한 조절 11
4. S-Adenosylmethionine (SAM) 13
5. S-Adenosylmethionine synthetase (SAM-s) 14
6. Avermectin, Oligomycin 및 Doxorubicin 18
6.1. Avermectin 18
6.2. Oligomycin 20
6.3. Doxorubicin 21
7. 연 구 목 적 25
Ⅱ. 재료 및 방법 27
1. 실험재료 및 조성 27
1.1. 균주 및 Plasmid 27
1.2. 배지 및 배양 조건 29
2. 실험방법 33
2.1. SAM-s gene cloning 및 발현 33
2.1.1. Plasmid DNA 의 분리 33
2.1.2. SAM-s gene의 유전자 cloning 33
2.1.3 SAM-s의 Open Reading Frame (ORF) 유전자 cloning 34
2.1.4. SAM synthetase의 발현 및 정제 37
2.1.5. 단백질 정량 38
2.1.6. SDS-PAGE 38
2.2. SAM-s의 효소활성 39
2.2.1. SAM synthetase의 in vitro 반응 39
2.2.2. SAM에 대한 Thin-Layer Chromatograph 분석 40
2.2.3. SAM-s의 반응물에 대한 HPLC 분석 40
2.2.4. SAM-s의 최적 pH 41
2.2.5. 효소의 최적 온도 및 열 안정성 41
2.2.6. Metal ion의 영향 42
2.2.7. Kinetic parameter 결정 42
2.3. 방선균에서 SAM 영향 43
2.3.1. 배양배지에 SAM 첨가의 영향 43
2.3.2. Avermectin 및 oligomycin 분석방법 43
2.3.3. Doxorubicin 분석방법 44
2.3.4. Streptomyces SAM-s gene를 위한 shuttle vector 제작 45
2.3.5. SAM-s gene의 Streptomyces에 transformation 45
2.3.6. 형질전환 방선균에서의 항생제 생성 영향 49
2.3.7. 전자현미경 사진 49
Ⅲ. 결과 및 고찰 53
1. SAM 첨가에 의한 항생제 생성에 대한 영향 53
2. S. avermitilis SAM-s gene의 분리 및 발현 59
2.1. S. avermitilis full SAM-s gene의 분리 59
2.2. S. avermitilis full SAM-s gene의 분석 61
2.3. E. coli에서 SAM-s gene의 발현 및 활성 확인 65
2.4. 결 론 71
3. SAM-s의 효소적 특이성 73
3.1. SAM-s에 대한 반응시간 결정 73
3.2. SAM-s의 최적 pH 74
3.3. SAM-s의 최적 온도 및 온도에 대한 안정성 74
3.4. Metal ion의 SAM-s에 대한 영향 75
3.5. SAM-s의 Kinetic parameters 82
3.6. 결 론 85
4. SAM-s의 과대발현에 의한 방선균의 형태학적 영향 및 항생제 생성에 대한 영향 87
4.1. 방선균에서 SAM-s gene에 의한 형태학적 영향 87
4.2. SAM-s가 과대발현된 방선균의 항생제 생성에 대한 영향 94
4.3. 결 론 100
Ⅳ. 종합결론 102
참고문헌 105
Abstracts 120
