Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cells in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) mouse model
중간엽줄기세포를 이용한 근위축성측삭경화증의 세포치료
- 주제(키워드) Mesenchymal Stem Cells (MSCs) , Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) , Neurogenin1 (Ngn1) , Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) , SOD1^(G93A) mouse
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 이영돈
- 발행년도 2005
- 학위수여년월 2005. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is characterized by progressive dysfunction and degeneration of motor neurons in cerebral cortex, brain stem and spinal cord. Degeneration of motor neurons causes muscle weakness and respiratory paralysis, leading to decease of ALS patients. Approximately 10% of the cases are familial and 20% of those are dominantly inherited mutations in superoxide dismutase 1 (SOD1). The transgenic animal model of ALS was the G93A mouse that expresses a mutant form of human SOD1 carrying the Gly93 → Ala and develops motor neuron disease similar to familial ALS. With the lack of effective drug treatments for ALS and compelling preclinical data, stem-cell research has highlighted this disease as a candidate for stem cell treatment. Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent that can be isolated from adult bone marrow and can be differentiated in vitro and in vivo into a variety of mesenchymal tissues. In the previous study, MSCs could be differentiated into neuronal cells by expression of a proneural gene, neurogenin1 (Ngn1). Ngn1 is a member of basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors expressed in neuronal precursors during the developing nervous system. Here this study showed that transplantation of MSCs transduced with ngn1, MSC-Ngn1, improved motor deficits of ALS symptoms in mice that carried a human mutant SOD1 transgene. Transplantation of MSC-Ngn1 prolonged the lifespan and delayed the onset of neurobehavioral degeneration as measured by extension reflex, rotarod, and Paw Grip Endurance (PaGE) tests. The behavioral improvement was accompanied by increased survival the motor neurons. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), which has been demonstrated to be the most potent neurotrophic factor for the proliferation, differentiation, and survival of spinal motor neurons, exhibits very good therapeutic potential for ALS. MSCs were infected with recombinant adenovirus GDNF (MSC-GDNF). The MSC-GDNF were transplanted into tail vein of ALS mice (~13 weeks of age), and the animals were evaluated on health and behavioral measures. Transplantation of the MSC-GDNF into tail vein delayed the onset of motor behavioral symptoms, and prolongs the life span. The results suggest that MSCs transplantation may provide an effective strategy for the treatment of ALS. Further study is needed to delineate the mechanism underlying the therapeutic effects of MSCs.
more초록/요약
근위축성측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)은 운동 신경세포가 선택적으로 파괴되는 퇴행성 뇌질환의 하나이다. 발병 후 환자 개개인에 따라 그 진행속도에 차이가 있으나 운동신경세포가 점차 소실되면서 근력 약화와 근위축을 초래하여 언어장애, 사지위약, 급격한 체중감소, 폐렴 등의 증세를 보이다가 결국에는 호흡장애 등으로 사망하는 질병이다. ALS의 약 10%는 가족 내 일정한 유전성을 보이지만(Familial ALS, FALS), 대부분에서는 산발성으로 발병된다. ALS의 발생원인은 다른 여러 퇴행성 뇌질환에서와 같이 아직 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 1993년 superoxide dismutase 1 (SOD1)의 유전자 돌연변이가 FALS의 원인 중 하나로 밝혀졌고, 이를 이용한 ALS 동물 모델이 개발되면서 새로운 치료제 연구가 활발히 진행되고 있다. 유전자 조작에 의해 돌연변이 된 사람의 SOD1을 과발현하는 ALS 모델 생쥐는 임상적으로 사람의 증세와 매우 유사하기 때문에 가장 보편적으로 사용되는 ALS 동물 모델이다. 중간엽줄기세포 (Mesenchymal Stem Cells, MSCs)는 연골세포, 지방세포, 골세포 등으로 분화하는 것으로 알려져 있으나 최근 들어 근육세포나, 간세포, 신경세포 등으로 분화 할 수 있다는 결과를 보임으로써 배아줄기세포처럼 다양한 분화능력을 가지고 있음이 밝혀졌다. 우리는 hMSCs에 뉴로제닌1 (Neurogenin1, Ngn1)을 발현시킴으로써 신경세포로의 분화를 유도하였다. Ngn1은 신경계 발생과정 동안 신경전구체에서 발현되는 bHLH 전사 인자들 중 하나로, 다른 전사인자들과 함께 신경계 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 선행연구를 통해 Ngn1을 발현하는 hMSCs (MSC-Ngn1)는 매우 높은 효율로 신경세포로 분화하는 것을 확인하였다. 우리는 hMSCs를 ALS 동물 모델에 이식하여 그 세포치료 효과를 확인하고자 하였다. hMSCs는 각각의 시기에 맞추어 생쥐 꼬리 정맥을 통해 이식하였다. 생쥐의 운동능력을 시험하기 위해 Extension Reflex, Rotarod, Paw Grip Endurance test 등을 수행하였다. 생후 8주된 생쥐를 사용하여 꼬리 정맥을 통해 106개의 hMSCs를 이식하였다. 꼬리 정맥을 통하여 이식한 hMSCs는 이식 후 2주 후에 확인한 결과 뇌와 척수로 이동하였음을 확인하였다. 세포를 이식 받은 ALS 모델 생쥐는 행동학적인 개선 효과 및 수명 연장 효과를 나타내었다. 조직학적인 분석 결과 척수 내 운동신경세포의 수에서도 MSC-Ngn1 그룹은 차이를 보였다. 또한 hMSCs 자체도 어느 정도의 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 위의 결과들을 통하여 hMSCs의 세포치료 효과와 그 외의 유전자 운반체로서의 활용 가능성을 제시하였다. 앞으로 이러한 효과에 대한 메커니즘 연구가 진행되어야 할 것이다.
more목차
CONTENTS
TITLE PAGE
CONTENTS = ⅰ
LIST OF TABLES = ⅲ
LIST OF FIGURES = ⅲ
ABSTRACT = ⅳ
ABSTRACT IN KOREAN = 41
Ⅰ. INTRODUCTION = 1
Ⅱ. MATERALS AND METHODS = 5
1. Materials = 5
2. Methods = 6
2.1. Animals = 6
2.2. Isolation of hMSCs from bone marrow aspirates = 6
2.3. Construction of Ngn1 Expression retroviral vector = 8
2.4. Production of retroviral supernatants = 9
2.5. Construction of MSC-Ngn1 stable cell lines = 9
2.6. Preparation of high titer viral stocks = 10
2.7. Adenoviral infection = 10
2.8. Western blot analysis = 10
2.9. Immunocytochemistry = 11
2.10. Preparation of hMSCs for transplantation = 11
2.11. Transplantation = 12
2.12. Behavioral tests = 12
2.13. Disease Onset and Survival = 14
2.14. Motor neuron Counting = 14
Ⅲ. RESULTS = 17
1. Distribution and immunophenotype of transplanted hMSCs = 17
2. Effect of hMSCs administration on Disease onset and Disease progression (Transplanted at 8 weeks of age) = 17
3. Effect of hMSCs administration on Disease progression (Transplanted at the time of disease onset) = 23
4. Effect of hMSCs administration on Disease progression (Transplanted at 13, 15 weeks of age Two times) = 23
5. Effect of GDNF expressing hMSCs administration on Disease progression (Transplanted at 13, 15 weeks of age Two times) = 26
Ⅳ. DISCUSSION = 32
Ⅴ. REFERENCES = 35
