Tissue-Engineered Skin Substitutes Using Gelatin and Fibrin Sealant
젤라틴과 피브린 접착제를 이용한 인공피부에 관한 연구
- 발행기관 亞洲大學校 大學院
- 지도교수 朴基東
- 발행년도 2005
- 학위수여년월 2005. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 학과간협동과정
- 본문언어 영어
초록/요약
Full thickness artificial skin was developed using gelatin and fibrin sealant with human skin cells and was evaluated for the biosafety, biocompatibility and efficacy. Gelatin is a partially denatured form of insoluble protein collagen, the major component of extracellular matrix of skin. It is reported that the RGD region of gelatin induces cellular adhesion by binding to integrin receptors, and this interaction has been known to play an important role in cell growth and differentiation. Fibrin sealant has also been demonstrated as a deliverly system for both growth factors and enhancer for growth factor gene expression. In this study, the salt leaching method was established for manufacturing gelatin scaffold and it can be an effective dermal substitutes through salt particle size regulation (100~300 ㎛ [small] and 300~600 ㎛ [large]). Each of the scaffold was performed characterization tests and in results [large] was estimated more effective in the gelatin scaffold. In the characterization tests, surface of scaffolds as observed more dense in small particle than in large particle using SEM observed. The porosity was estimated around 84.65 % in small particle and 76.59 % in large particle, and was demonstrated small particle size of salt at the same weight increased the porosity and surface area. In the mechanical strength, the yield point was measured 1.52 in large particle and 1.25 in small particle. Therefore dense surface also affected the mechanical strength. The water uptake ability showed about 30 times regardless of particle size, but in vitro degradation using the collagenase observed that the degradation rate was more than twice fast proportional to particle size. In the histological and immunohistochemical test, the large particle used scaffold showed more effective to increase the major ECM, collagen secretion after in vitro culture with fibroblast cell seeded. Manufacturing process was conformed biosafe and biocompatible , through sterility, endotoxin and mycoplasma tests as biosafety and skin irritation, intradermal reactivity and sensitization tests as biocompatibility. To complete full thickness composite skin substitutes, fibrin was sprayed with keratinocytes onto grafted dermal substitutes during two weeks, then those full thickness wound seems completely re-epithelialization. The histological analysis showed presence of stratified epidermal cell layer. Moreover, there was no contraction observed in the transplantation site of athymic mice. As as conclusion, these combined system was expected to use as an artificial skin for full thickness wound that was biosafe쇼 and biocompatibility.
more초록/요약
전 층 인공 피부는 사람 피부 세포와 함께 젤라틴과 피브린 접착제를 이용하여 개발되었으며, 생물안전성과 생체적합성 그리고 유효성이 평가되었다. 젤라틴은 피부의 주요 성분으로 세포외 기질인 콜라겐을 열 변성된 것이다. 젤라틴에 포함되어 있는 RGD 기전은 인테그린 수용체와 결합하여 세포부착을 유도하고, 이러한 상호작용은 세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 피브린 접착제는 또한 성장인자의 발현을 촉진하고 이들 운반체의 역할을 수행하는 물질로 증명된 바 있다. 본 연구에서는 젤라틴 지지체를 제조하기 위한 salt leaching 방법을 확립하고, salt 입자 크기 (100~300 ㎛ [작은 입자] and 300~600 ㎛ [큰 입자])를 조절함으로써 효과적인 진피 대체물을 제조할 수 있었다. 각각의 재료에 대한 특성분석 결과 작은 입자보다는 큰 입자의 지지체가 더 효과적인 지지체로 판단되었다. 특성화 시험에서, 표면 전자 현미경을 이용하여 지지체의 표면을 확인한 결과 작은 입자보다 큰 입자의 지지체가 더 조밀한 것으로 확인되었다. 공극률은 대략 작은 입자에서 84.65%, 큰 입자에서 76.59% 으로 측정되었고, 입자의 크기가 작아짐에 따라 공극률과 표면적이 증가한다는 것이 증명되었다. 인장강도에서는 항복점이 작은 입자에서 1.25, 큰 입자에서 1.52로 나타남으로써 표면이 조밀한 지지체가 인장강도가 높다는 것을 보여주었다. 흡습율의 경우 입자의 크기에 상관없이 약 30배 내외의 흡습율을 보였으나, 콜라겐 분해효소를 이용한 체외 생분해성 실험에서는 동일 조건에서 입자의 크기가 증가할 수 록 2배 이상 분해되는 것을 관찰하였다. 이러한 지지체를 체외 배양하여 조직염색과 면역염색을 통해 확인한 결과 큰 입자에서 세포외 기질성분인 콜라겐 타입 Ⅰ의 분비가 활발한 것이 확인되었다. 이러한 제조공정은 무균시험, 엔도톡신, 마이코플라즈마 실험을 통하여 생물 안전성을 확인하였고, 피부자극성시험, 피내반응, 감작성 시험을 통하여 생체 적합성을 확인하였다. 완전한 전 층 복합 피부 대체물을 위하여 제조된 진피 대체물을 이식하고 그 위에 피브린을 각질세포와 혼합하여 분사함으로써 피부 전 층이 완전하게 재상피화된 것을 나타내었다. 또한 조직염색을 통하여 층 분화된 표피층이 존재하는 것으로 확인하였다. 뿐만 아니라 이식한 부분을 확인한 결과 수축이 일어나지 않은 것이 관찰되었다. 결론적으로 생물 안전성과 생체 적합성을 갖춘 결합적인 형태의 이식 방법은 전 층 피부손상을 위한 인공피부로써 이용 될 수 있을 것이라 기대한다.
more목차
CONTENTS
감사의 글 = 1
ABSTRACT = 3
Ⅰ. Introduction = 5
Ⅰ-1. Background of tissue engineering = 5
Ⅰ-2. Necessity of the artificial skin = 5
Ⅰ-3. Structure and function of skin = 7
Ⅰ-4. Classification and characterization of artificial skin = 7
Ⅰ-5. Recent research trends on the artificial skin = 12
Ⅰ-6. Gelatin and fibrin sealant = 13
Ⅰ-7. Objective of this study = 15
Ⅱ. Materials and methods = 18
Ⅱ-1. Materials = 18
Ⅱ-2. Methods = 19
1. Design and characterization of scaffolds = 19
1-1. Preparation of salt-leached gelatin scaffold = 19
1-2. Morphological observation = 19
1-3. Measurement of pore size and porosity = 21
1-4. Mechanical strength test = 22
1-5. Water uptake ability = 22
1-6. In vitro biodegradation = 22
2. Cultures of skin cells = 24
2-1. Isolation of rabbit skin cells = 24
2-2. Human dermal fibroblasts = 24
2-3. Human epidermal keratinocytes = 25
3. In vitro culture of dermal substitutes = 26
3-1. Preparation of artificial dermis = 26
3-2. Cell attachment assay = 26
3-3. Histology and immunohistochemistry = 27
4. Transplantation test = 28
4-1. Grafting of skin equivalents to athymic mice = 28
4-2. Histological evaluation = 28
5. Biosafety and biocompatibility test = 31
5-1. Sterility test = 31
5-2. Endotoxin test (LAL test) = 31
5-3. Mycoplasma test = 31
5-4. Skin irritation test = 32
5-5. Intradermal reactivity test = 32
5-6. Sensitization tests = 32
5-6-1. Intradermal induction phase= 35
5-6-2. Topical induction phase = 35
5-6-3. Challenge phase = 35
5-6-4. Observation of the animals = 35
Ⅲ. Results and discussion = 38
Ⅲ-1. Preparation of crosslinked salt leaching scaffolds = 38
Ⅲ-2. Characterization of porous gelatin scaffolds = 39
1. Morphology observation and measurement porosity = 39
2. Mechanical strength and water uptake ability = 43
3. In vitro biodegradation = 46
Ⅲ-3. In vitro cultures of dermal substitutes = 46
Ⅲ-4. Transplantation test of the samples = 53
Ⅲ-5. Biosafety and biocompatibility test = 57
Ⅳ. Conclusion = 62
Ⅴ. References = 64
국문요약 = 71
