메타게놈으로부터 새로운 esterase의 cloning
Cloning of Novel Esterase from Metagenome
- 발행기관 亞洲大學校 大學院
- 지도교수 柳然禹
- 발행년도 2004
- 학위수여년월 2005. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
일반적으로 chiral성을 갖고 있는 의약품들의 대부분은 한 가지 enantiomer만이 약리활성을 갖는 것으로 알려지면서 최근 single enantiomer 의약품의 생산에 관심이 집중되고 있다. 본 연구에서는 비스테로이드계 소염진통제인 racemic ketoprofen을 효소적인 방법으로 (R)-과 (S)-ketoprofen을 분할하기 위하여 극히 제한된 수의 대략 1% 정도의 배양 가능한 미생물에서만 실험을 수행하는 것이 아니라, 난 배양성 및 미 배양 미생물등 여러 가지 다양한 원핵 미생물의 유전체가 혼합된 메타게놈으로부터의 균주탐색과 유전자 클로닝을 수행하였다. Esterase activity staining의 top agar overlay를 통해 1차 선별된 거대한 크기를 가진 fosmid clone을 여러 가지 제한효소 절단하였다. 제한효소의 선정 기준은 토양에 90% 이상을 차지하는 이미 잘 알려진 Pseudomonas 와 Bacillus esterase 유전자를 절단하는 제한효소 site가 많으면서, 그 외 다른 type의 종들이 가지는 esterase 유전자를 절단하는 제한효소 site가 적은 순서대로 clustal W program에서 multiple sequence alignment를 하여 Web cutter program에서 제한효소 site를 alignment 하였다. 선정된 여러 가지 제한효소를 처리하면서 esterase activity가 있는 2.5 kb의 DNA fragment를 얻을 수 있었고, pBluescript SK Ⅱ(+) vector에 subcloning을 하였다. Sequencing을 통해 얻어진 염기서열을 바탕으로 ORF search를 하여 esterase의 conserved domain을 포함하고 있는 870 bp의 nucleotide sequence의 ORF를 찾을 수 있었다. 290 개의 amino acid 서열의 상동성 분석결과 대부분의 esterase들과 50% 이하의 유사도를 보여주며, 새로운 형태의 esterase임을 확인 할 수 있었다. Blast search를 통한 검색 결과, Bacillus subtilis 유래의 brefeldin A esterase와 52%, Burkholderia cepacia R18194 유래의 esterase/lipase 와 34%, Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 유래의 carboxylesterase (estA), Bradyrhizobium japonicum USDA 110 유래의 probable esterase, Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 유래의 esterase/lipase와 33%, Sulfolobus solfataricus P2 유래의 lipase, Propionibacterium acnes KPA 171202 유래의 lipase/esterase와 32%, Symbiobacterium thermophilum IAM 14863 유래의 putative lipase와 30%의 유사성을 나타내었다. 또한 이들 esterase 모두 일반적으로 알려진 esterase의 active site인 Gly-X-Ser-X-Gly sequence가 존재함을 알 수 있었다. 그리고 재조합 단백질 정제를 위해 870 bp인 KYJ25를 pQE30 vector에 subcloning 하였다. SDS-PAGE에서 KYJ25 단백질 크기가 30 kDa이라는 것이 확인 되었고, ρNP ester 중에서 ρ-nitrophenyl acetate 에 대한 활성이 가장 높았으며, ρ-nitrophenylbutyrate보다 탄소 사슬이 4개 더 증가한 ρ-nitrophenylcaprylate는 그 활성이 약 10% 정도 급격히 떨어졌다. ρ-nitrophenyl acetate를 기질로 하여 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)에서 기질 농도를 변화시키면서 효소의 활성을 측정한 후 Lineweaver-Burk plot을 작성한 결과, K_(m)과 V_(max)가 각각 1.58mM과 84. 75 umoles/mg-protein/min으로 나타났다.
more초록/요약
The comparative study of enzymes that catalyze similar reactions but have a different substrate spectrum and/or stereospecificity is a powerful approach to understanding the reaction mechanism between the relative enzymes. This study was carried out to screen microorganism which produce enzyme with esterase activity, and we further attempted to clone the gene from microorganisms selected. To isolate novel strains that hydrolyzed the ethyl ester, we screened metagenome and soil samples in which the activity was expected to be found. A genomic library was screened for esterase activity by using α-Naphtyl acetate and Fast Blue RR salt. A novel esterase, KYJ25, was cloned from metagenomic library. KYJ25 esterase gene is encoded by 870 bp open reading frame and 290 amino acids with molecular weight of 30 kDa and pI of 5.22. That presented a the consensus active site sequence, G-X-S-X-G a typical sequence found in esterase family enzymes. BLAST search results with the esterase gene from KYJ25 revealed a relative low homology (30~50%) to other esterase and/or lipase from related strains. The esterase gene was subcloned to pQE30 vector. It produced histidine tagged esterase that could be purified by metal binding resin easily. KYJ25 esterase showed specific, higher activity for ρ-nitrophenyl acetate like short-chain ester substrates, confirming that the cloned enzyme is belonging to esterase family rather than lipase. Esters of longer fatty acids(>C8) were hydrolyzed at significantly lower rates. The specificity of purified esterase toward ρ-nitrophenyl acetate was confirmed by determining kinetic data that K_(m) and V_(max) were determined 1.58 mM and 84. 8 umoles/mg-protein/min, respectively.
more목차
목차
국문요약 = ⅰ
List of tables = ⅲ
List of figures = ⅳ
Ⅰ. 서론 = 1
1. 연구배경 = 1
2. 효소를 이용한 비스테로이드성 소염진통제의 광학분할 = 7
3. Esterase와 Lipase의 특성 = 11
4. 국내 메타게놈의 연구 동향 및 성과 = 14
5. 연구 목적 = 18
Ⅱ. 실험 재료 및 방법 = 19
1. 실험 재료 = 19
1.1 Soil samples = 19
1.2 균주 및 Plasmids = 19
1.3 배지 및 배양조건 = 20
1.4 시약 및 효소 = 20
1.5 Buffer 및 Solution = 22
2. 실험 방법 = 24
2.1 Esterase gene cloning from soil = 24
2.1.1 Chromosomal DNA 분리 = 24
2.2.1.1 DNA extraction using bead beating = 24
2.2.1.2 DNA extraction using sonication = 25
2.2.1.3 DNA extraction using enzymatic lysis = 26
2.2.1.4 Alternative lysis method(Soil kit) = 26
2.2.2 추출한 chromosomal DNA의 불순물 test = 27
2.2.3 Plasmid 분리 = 28
2.2.4 Electroporation용 competent cell 제조 = 29
2.2.5 Chromosomal DNA의 partial digestion과 plasmid full digestion = 29
2.2.6 100% Isopropanol precipitation 방법 = 30
2.2.7 Ligation = 30
2.2.8 Plasmid DNA의 electroporation = 31
2.2.9 Esterase positive clone 선별 = 31
2.2.10 Positive clone의 염기서열결정 및 분석 = 31
2.3 Esterase gene cloning from metagenome pool = 32
2.3.1 Metagenome pool = 32
2.3.2 Esterase positive clone 선별 = 34
2.3.3 Fosmid DNA 분리 = 34
2.3.4 선별한 30 kb positive clone을 여러 가지 제한효소로 digestion = 35
2.3.4.1 제한효소 Apa I digestion = 37
2.3.4.2 제한효소 Xho I digestion = 37
2.3.4.3 제한효소 Pst I digestion = 37
2.3.5 Cloning된 2.5 kb positive clone의 염기서열결정 및 분석 = 38
2.3.6 새로운 esterase 유전자 ORF cloning = 38
2.3.7 재조합 esterase의 정제 = 41
2.3.8 기질 특이성 = 43
3. 분석 방법 = 44
3.1 α-naphtyl acetate를 이용한 activity staining = 44
3.2 Ketoprofen LB top agar assay = 44
3.3 DNA 전기영동 = 44
3.4 SDS PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) = 45
3.5 단백질 정량 = 46
3.6 광학분할효소의 활성측정 = 46
3.7 Ketoprofen ethyl ester의 enzymatic resolution 분석 = 48
3.8 Kinetic parameter 결정 = 48
Ⅲ. 결과 및 고찰 = 50
1. 토양에서 ketoprofen ethyl ester에 광학활성을 갖는 ester hydrolase를 생산하는 novel한 균주 탐색 = 50
1.1 흙으로부터 chromosomal DNA 분리 = 50
1.2 Chromosomal DNA partial digestion = 53
1.3. Soil에서 추출한 chromosomal DNA로부터 esterase gene cloning ?= 55
1.4. Esterase positive clone의 선별 = 55
1.5. 토양에서 얻은 positive clone의 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) 분석 = 56
1.6. 흙에서 cloning한 esterase 유전자의 염기서열분석 = 56
2. Metagenome에서 ketoprofen ethyl ester에 광학활성을 갖는 ester hydrolase를 생산하는 novel한 균주 탐색 = 59
2.1 Metagenome pool 로부터 positive clone의 subcloning = 59
2.2 Metagenome pool에서 cloning한 positive clone의 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) 분석 = 62
2.3 Metagenome pool에서 cloning한 esterase유전자의 염기서열 분 = 62
2.4 KYJ25 esterase 유전자의 염기 및 아미노산 서열 분석 = 64
2.5 ORF cloning 및 재조합 esterase의 정제 = 70
2.6 ρ-nitrophenyl 유도체들에 대한 esterase의 활성 = 73
2.7 Kinetic parameter = 75
Ⅳ. 결론 = 78
References = 81
Abstract = 92
