Gene Delivery to the Mouse Embryonic Brain using in utero injection and in vivo Electroporation
자궁내 유전자 주입 기법을 이용한 생쥐배아의 뇌로의 효율적인 유전자의 도입
- 주제(키워드) mouse brain , electroporation , in utero , Id
- 발행기관 아주대학교 일반 대학원
- 지도교수 서해영
- 발행년도 2005
- 학위수여년월 2005. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
Development and differentiation of the nervous system is regulated by members basic helix-loop-helix (bHLH) proteins. Members of the bHLH proteins are negatively regulated by helix-loop-helix (HLH) family of Id proteins in muscle development and differentiation. Id proteins heterodimerize with bHLH transcription factors and prohibit expression of the target genes positively regulated by bHLH transcription factors. In consistence with a role as a negative regulator of differentiation, Id proteins are have been known as the positive regulators of cell proliferation. A technique by which genes can be introduced into the cells and tissues of developing embryos gas great potential for studying the roles of genes during vertebrate embryogenesis. The in utero injection and electroporation method, in which DNA is introduced into cells within a restricted area of developing was developed by the authors. We were trying to establish the method of condition with GRASS-Telefactor SD9 square pulse stimulator. Thus, we also utilized an in vivo electroporation method to introduce Id gene and marker gene (pCMV/β-gal) in restricted regions of the embryonic mouse brain. After electroporation at embryonic day of 13.5, the introduced genes were expressed in the regions closed to DNA injection sites.
more초록/요약
신경계의 분화와 발생은 bHLH 전사인자에 의하여 조절받는다. Id 유전자는 DNA와 결합할 수 있는 basic domain 이 없는 HLH 구조를 가지고 있는데, 이것이 bHLH 전사인자와 결합하면 불활성화된 구조를 형성하여 목적 유전자의 정상적인 발현을 억제하여 세포의 분화를 억제하고 분열을 촉진하는 역할을 한다. 이러한 Id 유전자의 생체내 기능을 밝히기 위해서 Id 유전자를 발생중인 생쥐의 배아로 도입시키고자 하였다. 유전자를 발생중인 생쥐의 배아내로 도입시키기 위하여 in vivo electroporation 기법을 이용하였다. 본 실험에서 사용한 방법은 새로운 유전자 도입기법의 하나인 in utero electroporation 이다. 이것은 DNA가 극성을 가진다는 것을 응용하여 원하는 DNA를 특정 영역에 미세관을 이용하여 직접 주입하고 DNA가 주입된 배아에 전기 자극을 가함으로써 유전자를 세포내로 전달할 수 있는 방법이다. 우리는 SD9 square pulse stimulator 를 이용하여 적정 조건을 확립하였고 이 방법을 이용하여 보고 유전자인 pCMV/β-gal 과 Id 유전자를 임신 13.5 일된 생쥐 배아의 한쪽 측뇌실에 미세주입하여 전기자극을 가하였다. 수술 후 2일이 지난 후, 배아를 추출하여 면역 조직화학 염색을 통하여 분석한 결과, 뇌의 특정영역에서 주입된 유전자의 발현을 확인할 수 있었다. 이로써 Electroporation 을 이용한 유전자 전달기법이 성공적으로 확립되었음을 알 수 있었다. 이 방법은 원하는 유전자를 플라스미드 벡터형태로 주입하기 때문에 바이러스를 이용하여 유전자를 도입할 때 드는 시간과 노력을 크게 줄일 수 있어 간단하며 매우 효율적으로 유전자를 전달할 수 있다. 따라서, 이 방법은 특정 유전자의 생체내 기능을 규명하는데 있어서 매우 좋은 도구로 사용될 수 있으리라 생각된다.
more목차
CONTENTS
TITLE PAGE
CONTENTS = ⅰ
LIST OF TABLES = ⅲ
LIST OF FIGURES = ⅲ
ABSTRACT = ⅳ
Ⅰ. INTRODUCTION = 1
Ⅱ. MATERALS AND METHODS = 4
1. Materials = 4
2. Methods = 5
2.1. Preparation of DNAs = 5
2.2. Western blot analysis = 5
2.3. In utero Surgery = 7
2.4. In vivo Electroporation = 7
2.5. Examination of the Electroporated Brains = 8
2.6. Contruction of Retroviral Vector = 9
2.7. Production of retroviral supernatants = 10
2.8. Titering retroviral vector = 10
2.9. Isolation of hMSCs from bone marrow aspirates = 11
2.10. Construction of hMSC/LacZ, hMSC/Id-flag stable cell lines = 12
2.11. Osteogenic differentiation of cultured hMSC stable cell lines = 12
2.12. Telomerase activity of hMSC/Id-flag stable cell lines = 13
Ⅲ. Results = 15
1. Expression of Id in vivo = 15
2. Optimal Condition for in utero Surgery and Electroporation = 15
3. Localized Expression of Introduced Gene = 16
4. Colocalization of Id and Nestin = 16
5. Id immortalization in hMSC = 17
Ⅳ. Discussion = 18
Ⅴ. REFERENCES = 32
국문 요약 = 35
