ERK1/2에 의한 Nicastrin 인산화와 감마시크리테아제 활성 변화 연구
Modulation of γ-secretase activity through ERK1/2 stimulated Nicastrin phosphorylation
- 주제(키워드) Alzheimer’s disease , Aβ , γ-secretase , Nicastrin , MEK1/2 , ERK1/2 , phosphorylation
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 백은주
- 발행년도 2005
- 학위수여년월 2005. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 학과간협동과정
- 본문언어 한국어
초록/요약
알츠하이머병 (Alzheimer's disease : AD)은 노인성 치매의 대표적인 질병으로써 대뇌피질과 해마부위에 베타 아밀로이드 단백질 (amyloid protein : Aβ)의 축적으로 인한 노인반점 (senile plague)과 신경돌기에서 세포 골격 연관 단백질인 타우 (tau protein)의 과인산화에 의한 신경섬유 덩어리 (neurofibrillary tangles)가 대표적인 병리학적 특징으로 보고 되어져 있다. Aβ는 아밀로이드 전구 단백질 (amyloid precursor protein: APP)로부터 베타시크리테아제 (β-secretase)와 감마시크리테아제 (γ-secretase)라는 단백질 분해 효소의 작용에 의해 생성된다. Beta site of APP cleaving enzyme (BACE) 단백질은 APP를 절단하여 Aβ가 생성될 수 있는 직접적인 기질을 제공하는 β-secretase로 알려진 단백질이며 presenilin1 (PS1) 단백질은 γ-secretase의 활성을 직접적으로 조절하는 단백질이다. PS1과 더불어 γ-secretase는 현재까지 Nicastrin, APH-1, PEN-2라는 4개의 단백질이 complex 구조를 하고 있는 것으로 보고 되어져 있다. 본 연구는 Aβ를 만드는 마지막 단계에 관여하는 γ-secretase의 활성에 영향을 미치는 생리학적 인자와 그 조절 기작을 밝히는 것이다. 현재, 노인반점에 의해서 세포내에서 일어나는 염증 반응과 세포 사멸을 일으키는 기작에 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호전달물질인 extracellular signal-regulated protein kinases 1/2 (ERK1/2), p38, stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase (SAPK/JNK)가 관련되어져 있다는 보고들이 있다. 이와 관련하여 screening과정에서 MAPK signaling pathway중 mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase (MEK1)의 활성 저해제인 PD98059가 γ-secretase 활성을 증가시키는 것을 발견하고, 이것을 토대로 MEK1 저해제에 의해 γ-secretase의 활성이 변화되어지는지를 luciferase assay, in vitro peptide cleavage assay 실험으로 확인하였다. 그 결과 MEK1이 불활성화 되어졌을 때, γ-secretase 활성이 증가한다는 것을 알 수 있었으며, 이것은 MAPK signaling pathway중 SAPK/JNK pathway나 p38 pathway와는 별개로 이루어진다는 것도 확인할 수 있었다. 다음으로는 MEK1 저해제에 의한 γ-secretase의 활성 변화의 원인에 대해 알아보고자 western blot으로 γ-secretase 각 구성 단백질의 발현 정도를 먼저 확인해 보았고, MAPK signaling pathway에서 MEK1의 하위 단계인 ERK1/2에 의한 인산화 가능 여부를 조사해 보았다. 그 결과 γ-secretase 구성 단백질의 발현 정도에는 변화가 없었지만, Nicastrin이 ERK1/2의 농도에 비례하여 인산화 되어지고, γ-secretase의 활성이 감소한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 in vitro 결과들과 더불어 세포에 MEK1-dominant negative DNA을 transfection하거나 ERK1/2에 대한 RNAi 실험을 통해 MEK-ERK pathway의 저해에 의하여 γ-secretase 활성이 증가되어진다는 것을 확인하였다. 이와 같이, 본 연구는 Aβ의 생성 조건에 관여하는 γ-secretase의 활성이 MAPK signaling cascade와 직접적으로 연관되어 있음을 증명하였고, 특히 ERK1/2에 의한 Nicastrin의 인산화가 중요함을 보여 주었다. 본 연구의 결과는 γ-secretase의 활성을 조절함으로써 Aβ의 생성을 억제하는 AD 치료제 개발의 목표점을 제시하고자 하였다.
more초록/요약
Amyloid beta (Ab) deposition in neuritic plaques of the brain plays an important role for the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). β- and γ-secretases are required to generate Ab peptide from the amyloid precursor protein (APP). The essential components of γ-secretase complex have been reported such as presenilin 1/2, nicastrin, PEN-2, APH-1 proteins. Although rapid progress has been achieved to reveal the identity and formation process of γ-secretase complex, endogenous regulation mechanism of γ-secretase activity is unknown. We demonstrated the treatment of MEK1/2 inhibitor, PD98059 and U0126, dramatically increased γ-secretase activity in various cell types including RGC-5 cell, ANPP cell and CHO cells without changing the expression of γ-secretase components. To differentiate the regulation mechanism of γ-secretase activity on MAPK pathway, p38 inhibitor and JNK inhibitor were treated. Treatment of both p38 inhibitor and JNK inhibitor did not show any increase of γ-secretase activity. Only ERK1/2 inhibitor showed marked increase of γ-secretase activity. To confirm the specific effect of ERK1/2 on γ-secretase activity, MEK1 dominant negative mutant cDNA to block ERK1/2 activity was transfected. MEK1 dominant negative mutant cDNA transfection showed marked increase of γ-secretase activity. To examine whether kinase activity of ERK1/2 in cytosol is important or transcriptional activity of ERK1/2 in nucleus is important, in vitro kinase assay with active ERK1/2 and isolated γ-secretase complex was performed. Active ERK1/2 phosphorylated nicastrin exclusively from the complex, suggesting that ERK1/2 directly phosphorylates one of the γ-secretase components in cytosol to regulate γ-secretase activity. Treatment of active phosphatase to the cells showed the increase of γ-secretase activity, supporting the idea that kinase activity of ERK1/2 is a major role to regulate endogenous γ-secretase activity. Our results provide direct evidence that ERK1/2 kinase activity directly regulates endogenous γ-secretase activity through phosphorylation of nicastrin.
more목차
목차
국문 요약 = ⅰ
차례 = ⅲ
그림 차례 = ⅴ
약어 = ⅵ
Ⅰ. 서론 = 1
A. 알츠하이머병의 병리학적 특징 = 1
B. APP 대사과정과 γ-secretase complex = 1
C. MAPK signaling pathway = 6
Ⅱ. 실험 재료 및 방법 = 7
A. 세포 배양 = 7
B. 시약 처리 = 7
C. Transient transfection of mammalian cells = 8
D. Luciferase reporter gene assay = 8
E. Crude membrane extraction과 in vitro γ-secretase-mediated peptide cleavage assay = 10
F. Western blot과 항체 = 11
G. In vitro ERK1/2 kinase assay of immunoprecipitated γ-secretase complex = 12
H. Dominant negative experiment = 13
I. RNA Interference = 13
Ⅲ. 실험결과 = 15
A. PD98059, U0126의 처리가 γ-secretase 활성을 증가시킨다 = 15
B. γ-secretase 활성은 MEK-ERK pathway에 의해 특이적으로 조절되어진다 = 17
C. ERK1/2는 γ-secretase 구성 성분인 Nicastrin를 인산화시킨다 = 19
D. γ-secretase 활성은 ERK1/2 농도에 비례하여 조절되어진다 = 21
E. γ-secretase 활성은 MEK1-D/N form과 RNAi에 의한 ERK1/2의 발현저하에 의하여 증가 되어진다 = 23
Ⅳ. 고찰 = 26
참고 문헌 = 31
Abstract = 40
목차
그림 차례
Figure 1. APP 대사 과정 = 2
Figure 2. γ-secretase complex-= 4
Figure 3. Luciferase reporter gene assay 모식도 = 10
Figure 4. Luciferase assay and in vitro peptide cleavage assay for MEK1inhibitor induced γ-secretase activity = 16
Figure 5. Luciferase assay and Western blot for SAPK/JNK pathway and p38 pathway = 18
Figure 6. Western blot and in vitro kinase assay for γ-secretase activity = 20
Figure 7. In vitro assay and in vitro kinase assay for ERK1/2 and γ-secretase complex = 22
Figure 8. MEK1-dominant negative DNA transfection experiment and ERK1/2 RNA interference = 25
Figure 9. Schematic diagram of endogeous γ-secretase complex activity modulation = 30
