대장균에서 생산하는 Xanthomonas 박테리오신의 부분정제 및 특성
Partial purification and characterization of Xanthomonase bacteriocins produced in Escherichia coli.
- 발행기관 亞洲大學校 大學院
- 지도교수 曺道鉉
- 발행년도 2005
- 학위수여년월 2005. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 공학계열
- 본문언어 한국어
초록/요약
박테리오신은 여러종의 미생물이 생산하는 천연의 항균성 단백질 또는, 단백질 계의 물질로서 일반적으로 박테리오신을 생산하는 미생물과 형태, 계통학적으로 유사한 균종에 대하여 살균 기작을 갖는 물질을 말한다. 항생제와는 달리 1차 생장에서 생산되며 모균주는 박테리오신에 대한 면역력을 가진다. Xanthomonads 계열의 균주는 병원성, 특히 식물관련 병원균주로서 경작에 많은 피해를 주고 있다. Xanthomonas campestris pv glycines 8ra가 생산하는 박테리오신은 Xanthomonads 계열만을 특이적으로 죽일 수 있다. 이에 박테리오신 활성이 있는 최소한의 유전자를 Escherichia coli를 이용하여 동정하였고 발현되는 박테리오신의 정확한 유전자 서열을 확인하기 위해 부분 정제를 하였다. 재조합된 E. coli를 12시간동안 배양하여 cell 파쇄 후 얻은 상등액에서 단백질을 추출하였으며 pH와 NaCl의 농도 조절을 통하여 펩타이드성 bacteriocin을 분리 하였다. 두 종류의 이온 교환 수지(Resource-Q, Resource-S)를 이용하여 분리하였으며 peptide gel filtration을 이용하여 bacteriocin을 부분 정제 하였다. 초기 재조합된 E. coli에서 발현되는 박테리오신은 2개 이상의 구조가 결합되어 있다. bacteriocin class Ⅳ에 해당한다. 분자량 cut-off 500 Da 투석막을 사용하였을 경우 박테리오신 활성을 완전히 잃어버렸다. 또한 펩타이드 gel 여과수지에서 phosphate보다 더 늦게 용출되었다. 이런 결과로 펩타이드성 박테리오신은 매우 짧은 펩타이드 사슬로 되어 있거나 linear한 형태일 것으로 추정된다.
more초록/요약
Bacteriocins are the proteinous antibiotics which are often plasmid encoded and produced by specific strains of bacteria. They are lethal against other strains of the same or related species. Unlike antibiotics, bacteriocins are produced in the primary phase of growth and bacteriocin-producing strains have the immunity against their own bacteriocins. The Xanthomonads are phyto-pathogens and do serious damage to crop plants. Bacteriocins produced by Xanthomonas campestris pv. glycines 8ra (Xc 8ra) specifically kill the family of Xanthomonas. In odrer to further study the bacteriocins produced by Xc 8ra strain, the minimum numbers of genes that are able to produce bacteriocins were isolated and identified using Escherichia coli (E. coli). The genetically recombined E. coli strain harboring the bacteriocin coding region was incubated for 12 hours and disrupted to obtain cell homogenate. After centrifugation, the supernatant was treated with varying amount of 1.0 M citric acid and NaCl to yield peptidic bacteriocins. The peptidic bacteriocins were purified using cation and anion ion exchangers (Resource-Q, Resource-S) and gel filtration chromatography(G-25 and peptide gel filtration column). According to the experimental data using Sephadex G-25, peptide gel filtration and molecular membrane dialysis, partially purified peptidic bacteriocins was supposed to be a linear structure or very short ones. The bacteriocins produced the recombined E. coli were at least in combined forms structures. Therefore they belongs to the Bacteriocin class Ⅳ. After dialysis with a membrane whose molecular cut-off is 500 Da, the bacteriocin activity was completely lost. The active peptidic fractions were eluted right often phosphate in peptide gel chromatography. These results may suggest that the active peptides have very short peptide chains, a linear form or both characteristics.
more목차
목차
List of Tables = ⅰ
List of Figures = ⅱ
국문요약 = ⅳ
Ⅰ. 서론 = 1
Ⅱ. 실험재료 및 실험방법 = 6
1. 실험재료 = 6
1-1. Bacterial strain = 6
1-2. 배지, 생장조건, 시약 = 6
1-3. 실험기기 = 7
2. 실험방법 = 7
2-1. Crude Extraction = 7
2-2. 지시균의 생장조건 = 8
2-3. Bacteriocin activity 측정 = 8
2-4. Peptidic bacteriocins의 Dissociation = 9
2-5. Bacteriocin의 분리, 정제 = 9
2-5-1. pH와 NaCl 변화에 의한 분리 = 9
2-5-2. PD-10(cut-off 5 kDa)에 의한 분리 = 10
2-5-3. Sephadex G-25를 이용한 Size exclusion chromatography에 의한 분리 =10
2-5-4. Resource-Q를 이용한 음이온 교환수지법 = 10
2-5-5. Resource-S를 이용한 양이온 교환수지법 = 11
2-5-6. Peptide gel filtration에 의한 분리 = 11
2-5-7. LC/MS를 이용한 서열 확인 = 12
2-6. 분리된 bacteriocin의 특성 = 12
2-6-1. Molecular weight cut-off 500 Da membrane test = 12
2-6-2. 역상 수지 test = 12
Ⅲ. 결과 및 고찰 = 14
1. 96 well plate를 이용한 지시균주의 생장조건 = 14
2. Bacteriocin 활성 및 생장 저해에 필요한 범위 측정 = 14
3. pH 와 NaCl에 의한 분리 = 15
4. PD-10을 이용한 분리 = 15
5. Dissociation test = 16
6. Bacteriocin의 부분 정제 및 특성 = 28
6-1. Sephadex G-25 column(gel filtration chromatography)에 의한 분리 = 28
6-2. 음이온 교환수지에 의한 분리 = 31
6-3. 양이온 교환 수지법에 의한 분리 = 35
6-4. 역상 수지를 이용한 분리 = 38
6-5. Peptide gel filtration에 의한 분리 = 40
6-6. Peptide gel filtration에서 타 성분의 영향 = 40
7. 분리 정제한 bacteriocin의 특성 = 44
7-1. pH에 따른 bacteriocin의 활성 = 44
7-2. 분자량 500 Da cut-off membrane을 이용한 투석 실험 = 44
7-3. LC/MS를 이용한 부분 정제된 bacteriocins의 peptide 서열 확인 = 45
Ⅳ. 결론 = 51
Ⅴ. 참고문헌 = 52
Abstract = 57
