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주폐포자충 폐렴 진단키트 개발 및 분석적 성능

  • 송홍주 (HONGJU SONG, 아주대학교 글로벌제약임상대학원)

초록/요약

주폐포자충 폐렴(PCP)은 일반적으로 HIV/AIDS 환자에서 발생하며, 약 70-80%의 환 자가 주폐포자충(Pneumocystis jirovecii) 폐렴에 감염되는 것으로 보고되고 있다. 객담 과 폐포세척액 등의 검체로부터 주폐포자충(P.jirovecii) 핵산을 검출하는 중합효소연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 검사 방법이 널리 사용되고 있으며, 민감도와 특이도가 높은 특징이 있다. 본 연구는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)기반의 제품으로 타겟 유전자 mtLSU를 표적으로 주폐포자충(P.jirovecii) 고유의 유전자와 Internal Control로서 human RNase P gene의 증폭 유무를 판단하여 정성 검출하도록 자체적으로 프라이머 및 프로브를 설계하여 NextGene™ P.jirovecii Detection Kit를 개발하고, 인실리코 분석 을 수행하였다. 또한, 분석적 성능을 평가하기 위하여 분석적 민감도, 분석적 특이도(교 차반응, 간섭반응, Carry-over), 분석적 정밀도 시험을 진행하였다. 인실리코 분석 결과, 제품의 프라이머와 프로브는 P.jirovecii를 특이적으로 검출하는데 적합한 것으로 확인 하였으며 제품의 최소검출한계 농도를 결정하기 위해 10가지 농도(4,000 ~ 7.8 copies/mL)의 샘플 농도에서 24번 반복 실험한 결과, 최소 검출 한계는 500 copies/mL 로 결정되었고, 교차반응이 예상되는 유사한 호흡기 감염 미생물(바이러스, 박테리아 등) 46종과 관련 간섭반응 물질 11종에 대한 영향을 확인한 결과 교차반응과 간섭반응 이 없음을 확인하였다. 또한, 키트의 Carry-over 오염에 대한 영향을 확인하기 위해 고 농도 표준물질(10,000X LoD)과 음성 검체를 번갈아 반복 실험을 진행한 결과, Carry-over 영향이 없음을 확인하였고, 정밀도를 확인하기 위해 반복성 및 재현성 평 가를 수행한 결과 본 제품은 검사 내, 검사 간, 날짜 간의 반복성과 장소 간, 실험자 간, 로트 간의 재현성을 나타내어 정밀도가 확인되었다. 결론적으로, NextGene™ P.jirovecii Detection Kit를 개발하여 분석적 성능을 평가한 결과 본 키트가 P.jirovecii 유전자를 효율적이고 신뢰성 있게 검출하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.

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목차

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 본론 2
A. 실험재료 2
B. 실험방법 2
1. NextGene™ P.jirovecii Detection Kit 검출 원리 2
2. 프라이머 및 프로브 설계 3
C. 검사 과정 (Multiplex Real-time PCR 방법) 7
1. 반응액 제조 7
2. Template 혼합 7
3. PCR 장비 설정 7
D. 분석적 성능 평가 8
1. 분석적 민감도 8
2. 분석적 특이도(교차반응) 8
3. 분석적 특이도(간섭반응) 10
4. 분석적 특이도(Carry-over) 10
5. 분석적 정밀도(반복성, 재현성) 11
E. 결과 분석 방법 11
F. 결과 12
1. 인실리코 분석 결과 12
2. 분석적 성능평가 결과 15
Ⅲ. 결론 및 고찰 21
A. 결론 21
B. 고찰 21
Ⅳ. 참고문헌 23

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