Optimization of lipid nanoparticles for pancreatic cancer therapy
치료용 단백질의 LNP 탑재와 생물학적 응용
- 주제(키워드) Lipid-nanoparticle , liposome , CRISPR-Cas system , protein delivery , gene delivery
- 주제(DDC) 615.1
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 윤태종
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 약학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032136
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Polymeric and inorganic nanoparticles studied by many researchers have advantages of cargo's flexibility (hydrophilic and hydrophobic substance) and are suitable for particle surface modification. However, they can induce cytotoxicity due to the low biocompatibility, possibility for aggregation and insolubility. In this respect, lipid-based nanoparticles (LNPs) are very attractive because of their high bioavailability and safety. In addition, LNPs may have the ability to bypass several extracellular and intracellular barriers as an ideal nano-carrier. Therefore, the critical challenges of developing LNPs require to (1) optimize condition of encapsulated cargos (drug, gene or protein), (2) have stable LNPs for cellular uptake, (3) target with recipient cells, (4) improve immune cell effect, (5) enhance the endosomal escape of cargos, and (6) transfer the cargos into the desired cell organelles. In this thesis I developed LNP that consider its challenges and apply to various biological therapy. In chapter 1, I demonstrated that dual-base editing of oncogenic KRAS mutation and mutant P53 overcome the gemcitabine resistance. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a difficult to diagnose in the early-stage and has a poor prognosis. Gemcitabine is used to be the first-line anti-cancer for chemotherapy, but this drug has been constrained by resistance in most of the PDAC patients. Oncogenic KRAS mutation and mutant P53 has correlation to regulation of aerobic glycolysis and non-oxidative pentose phosphate pathway (PPP). Therefore, I suggested improving the therapeutic strategy with dual-gene editing of KRAS and P53, which were found to be the most frequent mutation in PDAC. I developed nanoliposome (NL) which simultaneously encapsulated Cas9 and ABE protein for homogeneous dual-gene editing. In addition, I synthesized an anchored NL with anti-EGFR (NL-Ab) to exact tumor targeting in vitro and in vivo. After co-administrated NL-Ab(Cas9/ABE) and gemcitabine, tumor proliferation was inhibited dramatically. In chapter 2, I described the RNAi-based therapies and CRISPR/ Cas9 technology including cationic polymers, lipid-based nanomaterials, and inorganic nanoparticles for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Viral vectors (retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus vector) have been popular in the gene therapy field in recent years. However, they are limited by issues in clinical, which are related to the increased adaptive immune response from neutralizing antibodies by the capsids of adeno-associated virus, potential immunogenicity of a viral vector into a pathogenic virus, and oncogenic gene mutations by insertion into chromosomes. Therefore, I summarized an ideal vehicle for gene therapy with targeting specificity, minimizing off-target efficiency and retaining non-immunogenicity.
more초록/요약
많은 연구자들이 연구하고 있는 고분자 및 무기 나노입자는 내부에 봉입할 수 있는 물질 (유전 물질, 친수성 및 소수성 약물)의 특성이 다양하며, 입자 표면 개질도 용이하다는 장점이 있다. 그러나 낮은 생체 적합성, 응집 가능성 및 일부 난용성으로 인해 세포 독성을 유발할 수 있다. 이와 관련하여, 지질 기반 나노 입자 (lipid nanoparticle; LNP)는 높은 생체 적합성과 생 분해성으로 인해 아주 매력적인 소재로 떠오르고 있다. 또한, LNP는 이상적인 나노 운반체로서 세포 외 및 세포 내 장벽을 우회하는 특성을 가질 수 있도록 변형이 용이하다. 따라서 LNP 개발의 주요 과제는 (1) 내부에 봉입 된 물질 (유전 물질, 단백질, 친수성/소수성 약물)의 조건 최적화, (2) 세포 흡수를 위한 보관 안정성이 뛰어난 LNP 합성, (3) 표적 세포로 표적화, (4) 면역 세포와의 상호작용 개선, (5) 봉입 된 물질의 엔도솜 탈출을 향상시키고, (6) 봉입 된 물질이 최종적으로 전달 되어야하는 세포 소기관에 도달해야 한다. 본 논문에서는 이러한 사항을 고려하여LNP를 개발하였고, 이것을 다양한 생물학적 치료에 적용할 수 있는 방법을 서술하였다. 1장에서는 발암성 KRAS와 P53 돌연변이의 이중 염기 편집에 의해 젬시타빈 내성을 극복함 할 수 있음을 입증하였다. 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma; PDAC)은 초기에 진단하기 어렵고 예후가 좋지 않다. 임상적으로 젬시타빈은 화학 요법의 1차 항암제로 사용되지만 PDAC 환자에서 내성이 확인되어, 제약을 받고 있다. 발암성 KRAS 및 P53 돌연변이은 호기성 해당과정 및 비산화성 오탄당 인산 경로 (pentose phosphate pathway; PPP)의 조절과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 우리는 PDAC에서 가장 빈번하게 돌연변이를 발견한 KRAS와 P53의 이중 유전자 편집으로 치료 전략을 개선할 것을 제안하였다. 논문에서 이중 유전자 편집을 위해 Cas9와 ABE 단백질을 동시에 캡슐화한 나노리포좀(NL)을 개발하였다. 또한, 세포 수준 혹은 동물 모델에서의 정확한 종양 표적화를 위해 NL의 외부 표면에 EGFR 항체가 붙어있는 형태인 NL-Ab로 변형 하였다. 결론적으로, 합성된NL-Ab(Cas9/ABE)와 젬시타빈을 병용 투여한 후 젬시타빈의 내성이 치료되어 종양이 극적으로 억제되는 것을 확인하였다. 2장에서는 췌관 선암종(PDAC)에 대한 양이온성 고분자, 지질 기반 나노물질, 무기 나노입자를 포함한 RNAi 기반 치료법과 CRISPR/Cas9 기술에 대해 설명하였다. 최근, 유전자 치료 분야에서 바이러스 벡터 (레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 벡터)를 활용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 캡시드의 중화 항체로 인한 적응 면역 반응 증가, 병원성 바이러스로의 바이러스 벡터에 대한 잠재적 면역원성, 염색체 삽입에 의한 발암성 유전자 돌연변이 가능성과 관련된 임상적인 문제점을 갖고있다. 따라서, 우리는 이 리뷰 논문을 통해 표적화 특이성, 표적외 효율성 최소화 및 비면역원성을 갖는 유전자 치료를 위한 이상적인 나노 입자에 대해 정리하였다.
more목차
Chapter 1. One-shot dual gene editing for drug-resistant pancreatic cancer therapy 1
1.1 Abstract 2
1.2 Introduction 3
1.3 Materials and methods 6
1.3.1. Selection of KRAS and P53 sgRNA target sequence 6
1.3.2. Expression and purification of Cas9 and ABE 7.10. 6
1.3.3. In vitro T7 transcription of sgRNA 7
1.3.4. The activity of purified Cas9 and ABE7.10. 7
1.3.5. Cell culture and transfection 8
1.3.6. Synthesis and characterization of nanoliposomes 9
1.3.7. Quantitative PCR analysis 10
1.3.8. Immunofluorescence 11
1.3.9. Western blot analysis 11
1.3.10. Cell viability assay 12
1.3.11. Flow cytometry of apoptosis and cell cycle 12
1.3.12. Tumor xenograft study 12
1.3.13. Next-generation sequencing 13
1.3.14. H&E, IHC, IF, and TUNEL assay 13
1.3.15. Statistical analysis 14
1.4 Results 15
1.4.1. Cas9 and ABE protein preparation 15
1.4.2. Antibody conjugated nanoliposomal particles (NL-Abs) preparation and encapsulation of Cas9/ABE-RNP 20
1.4.3. In vitro gene editing 26
1.4.4. In vitro therapeutic effect 30
1.4.5. PDAC-specific targeting in vivo 38
1.4.6. In vivo therapeutic application 40
1.5 Discussion 45
1.6 Conclusion 47
1.7 References 48
Chapter 2. Gene Therapy Using Nanocarriers for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: Applications and Challenges in Cancer Therapeutics 52
2.1 Abstract 53
2.2 Introduction 54
2.3 RNAi Therapy for Pancreatic Cancer 57
2.3.1. RNAi Using miRNAs 57
2.3.2. RNAi Using siRNAs 59
2.4 CRISPR-Cas Gene Editing 65
2.4.1. Plasmid DNA (Cas9/sgRNA plasmid) Delivery 68
2.4.2. In Vitro Transcribed Cas9/sgRNA mRNA Delivery 71
2.4.3. Pre-assembled Ribonucleoprotein (RNP) Complex Delivery 71
2.5 Conclusions and Future Perspectives 77
2.6 References 79
