나노섬유 기반 3차원 환경을 이용한 폐 비임상 모델에 대한 연구
A study on the lung nonclinical model using a nanofiber-based three-dimensional environment
- 주제(키워드) 나노섬유 , 폐 비임상 모델 , 3차원 환경
- 주제(DDC) 610
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 곽종영
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031977
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
3차원 세포 배양은 2차원 세포 배양 연구의 한계를 극복하고, 실험 동물 모델의 문제점을 대체 보완할 수 있는 모델로서 부각되었다. 3차원 세포 모델은 나노섬유를 기반으로 하여 하이드로젤(Hydrogel) 시스템을 합쳐 공배양 환경을 구축할 수 있다. 나노섬유는 전기방사를 통해 chloroform을 용매로 한 poly ε-caprolactone(PCL) 나노섬유(이하 C-PCL)와 poly vinyl alcohol(이하 PVA) 나노섬유를 제작한다. PVA 나노섬유의 조건을 확인하기 위해 퓨리에 변환 적외선 분광기(FT-IR)와 주사 전자 현미경을 통해 확인한다. PVA 나노섬유에는 MLE-12 세포를 배양하며, 배양 효과를 높이기 위해 PVA에 laminin 펩타이드를 농도별로 함유하여 최적의 laminin 함유 PVA 나노섬유를 제작한다. 하이드로젤은 alginate를 이용하며 MLE-12 세포 배양에 적합한 농도를 결정하고 적절한 mucin 농도를 혼합한다. PVA 나노섬유는 상층(Transwell) 그리고 C-PCL은 하층(24well 세포배양접시)에 부착하여 공배양 환경을 구축한다. 공배양 환경에서 Transwell에는 폐 상피세포인 MLE-12 세포를 배양하고, 24well 세포배양접시에는 섬유아세포인 3T3 세포를 배양하여 MLE-12 세포 배양에 미치는 효과를 확인한다. 그 후, 3T3 세포와 면역세포인 수지상세포(Dendritic Cell, 이하 DC)를 24well 세포배양접시에 직접적 공배양을 통해 DC에 활성화를 확인한다. 마지막으로 상층에는 laminin 함유 PVA 나노섬유에 MLE-12 세포를 배양한 뒤 mucin alginate를 덮고, 하층에는 C-PCL에 DC와 3T3 세포를 alginate와 함께 배양하여 3차원 폐 비임상 모델을 구축한다. 이 모델의 외부 항원으로 세로무늬 먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinu)에 의해 생성된 단백분해효소(이하 Der p)를 이용하며, Der p 처리에 따른 3차원 폐 비임상 모델에서의 반응을 사이토카인 측정으로 확인한다. 이를 적용시켜 2차원적 세포 배양 연구 및 실험 동물 모델의 한계와 문제점을 극복하는데 활용할 수 있다. 핵심어 : 3차원 세포 배양, 나노섬유, 공배양, 하이드로젤, 폐 상피세포, 섬유아세포, 면역세포, 3차원 폐 비임상 모델
more초록/요약
Three-dimensional cell culture has emerged as a model that can overcome limitations of two-dimensional cell culture research and tackle problems of experimental animal models. The three-dimensional cell model can build a co-culture environment by combining hydrogel system and nanofiber structure. Nanofibers, such as poly ε-caprolactone nanofibers using chloroform as a solvent (C-PCL), polyvinyl alcohol (PVA) nanofibers, were produced via electrospinning. The properties of PVA nanofibers were confirmed through Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and scanning electron microscopy. MLE-12 cells were cultured on PVA nanofibers, and laminin peptides were blended in PVA with defined concentrations to increase the culture effect, thereby producing optimal laminin derived peptide-containing PVA nanofibers. The concentration of hydrogel using alginate together with mucin, were optimized for MLE-12 cell culture. PVA membrane was attached to the upper layer (Transwell insert) and C-PCL was attached to the lower layer (24-well cell culture dish) to establish a co-culture environment. MLE-12 cells, which are lung epithelial cells, were cultured in the upper layer, and 3T3 cells, which are fibroblasts, were cultured in the lower layer to investigate the effect of 3T3 cells on MLE-12 cells. At the next step, 3T3 cells and immune cells, which are dendritic cells (DC), were directly co-cultured on the lower layer to confirm the activation of DCs. After that, MLE-12 cells were cultured on laminin derived peptide-containing PVA nanofibers on the upper layer and covered with mucin alginate, while DC and 3T3 cells were mixed with alginate and then cultured on C-PCL on the lower layer to build a lung non-clinical model. By using the protease (Der p) produced by the dust mite (Dermatophagoides pteronyssinu), known as the allergen of the asthma model, the response in the 3D lung non-clinical model following Der p treatment was tested by cytokine measurement. This model can be used to overcome the limitations and problems of two-dimensional cell culture research and experimental animal models. Keyword: Three-dimensional cell culture, nanofiber, co-culture, hydrogel, lung epithelial cells, fibroblasts, immune cells, 3D lung non-clinical model
more목차
Ⅰ 서론 1
Ⅱ 실험재료 및 방법 3
A. 실험 재료 3
B. C-PCL 및 laminin PVA 나노섬유 제작 및 전기방사 4
C. 퓨리에 변환 적외선 분광기(FT-IR) 4
D. 나노섬유 펩타이드 함유성 확인 방법 5
E. Laminin PVA 나노섬유 펩타이드 세포 독성 확인 방법 5
F. Alginate와 mucin 및 cross-linking solution 제조 5
G. MLE-12와 3T3 세포 배양 6
H. 마우스 골수에서 수지상세포 채취 6
I. Hydrogel 시스템 기반 공배양 환경 7
J. 세포 면역 화학 염색법(Immunocytochemistry) 7
K. 공초점 레이저 현미경(Confocal laser microscope) 8
L. 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM) 8
M. 세포 증식 분석(Cell proliferation assay) 8
N. 효소 결합 면역 흡착 검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 9
O. 통계 분석 (Statistical analysis) 9
Ⅲ 결과 10
A. C-PCL 및 PVA 나노섬유의 형태 및 세포 관찰 10
B. PVA 나노섬유 3차원 배양 조건 확인 12
C. PVA 나노섬유에 함유 laminin 펩타이드 최적 농도 확인 14
D. Laminin PVA 나노섬유 펩타이드 함유성 확인 16
E. Laminin PVA 나노섬유 세포 독성 확인 19
F. Laminin PVA 나노섬유에서 마우스 폐 상피세포 관찰 21
G. Alginate hydrogel 시스템 기반 마우스 폐 상피세포 관찰 23
H. 마우스 폐 상피세포와 섬유아세포 간접적 공배양 환경에서 세포 관찰 26
I. 섬유아세포와 직접적 공배양을 통한 수지상세포 활성화 확인 29
J. 다양한 농도의 Der p 처리에 따른 세포 반응 확인 32
K. Laminin PVA 나노섬유와 hydrogel 시스템 기반 3차원 공배양 환경에서 Der p 처리 및 사이토카인 측정 35
Ⅳ 고찰 38
Ⅴ 결론 40
참고문헌 41
ABSTRACT 45
