세포 노화에서 DNMT1의 하위 조절자로서 SPINT2 작용 기전 연구
- 주제(키워드) Cellular senescence , DNMT1 , SPINT2 , c-Met
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 윤계순
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031350
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
As senescence develops, cells sequentially acquire diverse senescent phenotypes along with simultaneous multistage gene reprogramming. In previous studies, DNMT1 which can control various gene expression at the same time was downregulated at the early stage of at initiation of senescence reprogramming and acted as a master regulator of subsequent senescence phenotypes. Its six potential downstream target genes were identified. In this study, I investigated the involvement of SPINT2, a downstream target of DNMT1, in senescence and its regulation by DNMT1. First, their gene expression patterns and correlation analysis in replicative senescence(RS) model showed negative correlation between DNMT1 and SPINT2. Down- expression of DNMT1 and upregulation of SPINT2 were observed in the early stages of RS at which the increase in cell size, cell granularity and senescence-associated β-galactosidase(SA-β-gal) activity have not developed. Also, the negative correlation between DNMT1 and SPINT2 was also observed in oxidative stress induced senescence model. When the activity of DNMT1 was inhibited by 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AzC) or siRNA-mediated knockdown of DNMT1, increased SPINT2 mRNA and protein expression was observed, and cellular senescence was induced. In addition, DNMT1 was proved to be an upstream regulator of SPINT2, evidenced by combined knockdown of both genes and SPINT2 overexpression. To determine how DNMT1 regulates SPINT2, a luciferase reporter vector with SPINT2 promoter DNA(2 kb length) was produced. By analyzing promoter activity of several deletion forms of SPINT2 promoter reporter plasmid. I identified an important region of the SPINT2 promoter which is regulated by DNMT1. SPINT2 is known to regulates the HGF/c-Met signaling pathway. When SPINT2 was overexpressed, c-Met phosphorylation status was decreased. Knockdown of c-Met induced senescence phenotype. Gene expression profiling analysis was performed to analyze the downstream effectors of c-Met. Among potential downstream effectors, three genes (COL27A1, STAM2, CBL) were regulated by SPINT2 overexpression. Based on these results, I concluded that the reduction of DNMT1 increases SPINT2 and inhibited the HGF/c-Met signaling pathway, thereby inducing senescence phenotype. These results suggest that DNMT1 is a key early regulator that regulates senescence by modulating SPINT2/HGF/c-Met signaling pathway.
more초록/요약
복제 노화(replicative senescence)가 진행될 때, 세포는 시기에 따라 서로 다른 많은 유전자들의 발현이 변화함과 동시에 다양한 노화 표현형을 획득한다. 이전 연구에서 여러 유전자 발현을 동시에 조절할 수 있는 DNMT1이 복제 노화의 초기 단계에 하향 조절되어 유전자 재프로그래밍을 관장함으로써 후속 노화 표현형의 마스터 조절자로 작용함을 확인하였고, 6개의 핵심적인 하위 타겟 유전자를 발굴하였다. 본 연구에서는 DNMT1의 하위 유전자 중 SPINT2를 중심으로 유전자조절 및 노화조절 기전을 밝히고자 하였다. 먼저 복제 노화 모델에서의 유전자 발현 패턴과 발현 상관성 분석을 통하여 DNMT1와 SPINT2가 서로 상반되는 상관관계(negative correlation)을 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 DNMT1의 발현감소와 SPINT2의 발현증가 패턴은 복제 노화과정에서 senescence-associated β-galactosidase(SA-β-gal) 활성도 없이 세포크기 및 cell granularity가 증가하는 초기 단계부터 나타남을 확인하였다. 또한 산화스트레스 노화모델에서도 공통적으로 나타나는 중요한 현상임을 확인하였다. DNMT1의 활성저해제인 5-aza-2'-deoxycytidine(5-AzC)을 이용하여 활성을 억제하거나 siRNA를 이용하여 DNMT1의 발현을 억제시켰을 때, SPINT2의 mRNA와 단백질 양이 증가하고 cellular senescence가 유도됨을 확인하였다. 또한 두 유전자의 siRNA를 이용한 발현억제 및 Lentivirus를 이용한 SPINT2 과발현을 통해 DNMT1이 SPINT2의 상위조절자임을 확인하였으며, SPINT2의 과발현만으로도 노화가 유도됨을 확인하였다. 또한 DNMT1의 감소가 어떻게 SPINT2를 조절하는지 확인하기 위하여 2kb 길이의 SPINT2 promoter DNA를 가지는 luciferase 리포터 벡터를 제작하였고, deletion 형태를 제작하여 promoter 활성을 분석함으로써 assay를 통해 siRNA를 이용한 DNMT1의 감소 시 SPINT2의 promoter activity의 증가를 측정함으로써 DNMT1이 작용하는 특정 promoter 부위를 확인하였다. SPINT2는 HGF/c-Met 신호 경로를 조절한다고 알려져 있어서, SPINT2의 과발현 후 c-Met의 phosphorylation 상태를 확인하였을 때, 인산화가 감소하는 것을 확인하였고, siRNA를 통한 c-Met의 감소만으로도 노화가 유도됨을 확인하였다. 유전자 발현 프로파일링 분석을 통하여 c-Met의 하위조절자를 분석하고 mRNA 양을 검증하여 3개의 gene(COL27A1, STAM2, CBL)가 SPINT2 과발현에 의해 조절됨을 확인하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 DNMT1의 감소가 SPINT2를 증가시키고, HGF/c-Met 신호체계를 억제하여 노화 표현형을 유도한다는 결론을 도출하였다. 본 연구결과로 DNMT1이라는 노화의 초기 조절자가 SPINT2/HGF/c-Met 신호체계를 조절하여 노화를 조절하는 핵심 유전자임을 증명하게 되었다.
more목차
Ⅰ . 서론 1
Ⅱ . 실험재료 및 방법 13
A. 세포 배양 및 노화 모델 개발 13
B. Western blot analysis 13
C. RNA 분리 and cDNA 합성 14
D. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-qPCR) 14
E. Senescence-associated β-Galactosidase Activity Staining 15
F. SPINT2 pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-puro SPINT2 plasmid 재조합 및 Lentivirus 생산 and siRNAs transfection 16
G. Promoter-Luciferase Reporter plasmid 재조합 및 Promoter assay 17
H. 세포의 size 및 granularity 측정 18
I. 유전자 발현 프로파일링 및 데이터 분석 18
Ⅲ . 결과 20
A. 시간별 RS models에서 DNMT1과 SPINT2의 상반되는 상관관계 20
B. RS models에서 SPINT2의 발현 22
C. Replicative senescence 시 senescence 표현형 확인 24
D. OSIS models에서 DNMT1과 SPINT2의 상반되는 상관관계 26
E. DNMT1 활성 억제를 통한 SPINT2 발현 및 노화 유도 28
F. SPINT2의 상위조절자인 DNMT1 30
G. DNMT1에 의한 SPINT2의 전사 조절 32
H. SPINT2 과발현을 통한 c-Met 신호경로 억제 및 노화 유도 34
I. 유전자 발현 프로파일링을 이용한 SPINT2에 의해 조절되는 하위 유전자 발굴 36
Ⅳ . 고찰 및 결론 38
참고 문헌 42
ABSTRACT 52
